Un guide pour la purification des protéines recombinantes de haute qualité: optimisation des processus en aval et applications de filtration de flux tangentiel

Les protéines recombinantes sont largement utilisées dans les biopharmaceutiques, le développement des vaccins et les diagnostics in vitro . leur qualité de purification a un impact direct sur l'activité, la stabilité et la sécurité du produit final . en aval de purification en aval l'évolutivité, devient de plus en plus un outil vital dans les flux de travail de purification des protéines .

Cet article décrit systématiquement les étapes clés de la purification en aval des protéines recombinantes, en mettant l'accent sur les stratégies d'application de la technologie TFF . vise à aider les utilisateurs de recherche et industriels à optimiser les processus de purification et à améliorer la qualité des protéines .

 

I . ÉTAPES DE CORE DANS LA PURIFICATION en aval des protéines recombinantes

1. Récolte et lyse de cellules

Centrifugation / Filtration de profondeur: élimine les débris cellulaires et les impuretés; Convient pour les bactéries, la levure, etc. ., Systèmes d'expression .

Sonication / homogénéisation à haute pression: brise les cellules pour libérer des protéines cibles; Les conditions nécessitent une optimisation pour prévenir la dénaturation des protéines .

Lyse enzymatique: e . g ., traitement par lysozyme pour les bactéries; conditions douces mais coût plus élevé .

2. Purification primaire: Capture de la protéine cible

Chromatographie d'affinité (e . g ., His-Tag, protéine A / G): liaison élevée de spécificité; atteint une pureté élevée en une seule étape .

Chromatographie d'échange d'ions (IEX): sépare les protéines en fonction des différences de charge; Convient pour la purification du stade précoce à la mi-minuscule .

Chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC): utilise des différences dans l'hydrophobicité de la surface des protéines; efficace pour certaines protéines difficiles à purifier .

3. polissage: améliorant la pureté

Chromatographie d'exclusion de taille (SEC): élimine les agrégats et les petites impuretés molécules; Capacité de chargement limitée .

Chromatographie multimodale (e . g ., capto adhere): combine plusieurs modes d'interaction pour une résolution supérieure .

4. Concentration et échange de tampons

Dispositifs centrifuges ultrafiltration: adaptés aux échantillons à petite échelle; sujette à la perte de protéines .

Filtration de flux tangentiel (TFF): efficace, évolutif, idéal pour la production industrielle (détaillée plus tard) .

5. Stérilisation et stockage

0 . 22 µm Filtration: élimine les micro-organismes assurant la stérilité.

Ajout de stabilisateurs (e . g ., glycérol, bsa): empêche la dégradation des protéines .

 

II . Applications clés de la filtration de flux tangentiel (TFF) en purification en aval

La filtration de l'écoulement tangentiel (TFF) réduit l'encrassement de la membrane via l'écoulement tangentiel, ce qui le rend adapté à la concentration, au dessalement et à l'échange de tampons d'échantillons de grand volume . il offre des avantages significatifs sur la filtration impassible (E . g ., un centrifulation ultrafiltrée) {5}

 

1. Avantages de la technologie TFF

✔ Récupération élevée: minimise les pertes d'adsorption des protéines, particulièrement cruciales pour les échantillons précieux .

✔ Évolutivité linéaire: applicable de l'échelle de laboratoire (10 ml) à l'échelle de production (1000L +) .

✔ Flexibilité du processus: un seul système peut effectuer une concentration, une dialyse (échange de tampons) et une diafiltration .

 

2. Guide de sélection de cassette / membrane TFF

Matériau membranaire	Caractéristiques	Scénarios d'application
Polyethersulfone (PES)	Lower-liaison protéique, chimiquement stable (résistant au pH), flux élevé	Conditions tampons dures
Cellulose régénérée (RC)	Faible liaison aux protéines, flux élevé, protéine de routine	Purification des protéines / anticorps de routine

Lignes directrices de sélection de coupure de poids moléculaire (MWCO):

1/3 à 1/5 du poids moléculaire de la protéine cible (E . g ., utilisez une membrane de 10 kDa pour une protéine de 30 kDa) .

Pour supprimer les agrégats, choisissez une taille de pores plus petite (E . G ., utilisez une membrane de 50 kDa pour une protéine de 100 kDa) .

 

3. Optimisation des paramètres de fonctionnement TFF critiques

Pression transmembranaire (TMP): généralement 3 à 15 psi; TMP excessivement élevé favorise l'encrassement .

Débit tangentiel: maintient la turbulence pour minimiser la polarisation de la concentration; généralement 4–8 l / min · m² .

Techniques d'amélioration des rendements:

Utilisez 2 à 5 volumes de tampon pendant la diafiltration pour l'échange complet .

Effectuer un rétro-flacon à la fin pour récupérer la protéine résiduelle .

 

4. Étude de cas typique: purification des anticorps monoclonaux (MAB)

Culture cellulaire clarifiée Fluide → Protéine A Chromatographie d'affinité → Inactivation virale à faible puiss

 

Rôle TFF:

Concentre rapidement la protéine diluée A Éluer à la concentration cible .

Échange le tampon en PBS ou en tampon de formulation (e . g ., tampon d'histidine) .

 

Iii . Problèmes et solutions courantes

❌ Problème 1: Faible récupération en protéines

Causes possibles: adsorption de la membrane; précipitations dues à la sur-concentration .

Solutions: Passez à la membrane à faible liaison; Ajouter un surfactant (e . g ., 0 . 01% Tween 20).

❌ Problème 2: déclin rapide du flux

Causes possibles: Polarisation de l'encrassement de la membrane ou de la concentration .

Solutions: optimiser le débit tangentiel; mettre en œuvre régulièrement le rétro-flacon; Passez à une structure membranaire plus ouverte (e . g ., 30 kDa au lieu de 10 kDa) .

❌ Problème 3: Aggrégation des protéines

Causes possibles: force de cisaillement excessive; tampon inadapté .

Solutions: réduire la vitesse de la pompe; Utilisez des tampons plus doux (e . g ., contenant du saccharose ou du nacl) .

 

IV . Résumé

L'obtention de protéines recombinantes de haute qualité repose sur l'optimisation de la technologie de filtration de flux tangentiel (TFF), avec son efficacité et son évolutivité, est devenue un outil essentiel pour la concentration et l'échange de tampons . en sélectionnant rationnellement les cassettes de membrane, à l'optimisation des paramètres opérationnels et en intégrant les techniques de chomatographie, à la fois des protéines et des chomatographies à la fois, et et et à des chomatographies de canneaux, et à des techniques de chomatographie, à des protéines et à des chromatographies pour les canons à canaliser et à des chomatographies à la fois et à des chromatographies, à des protéines et à des chromatographies à la fois et à des chromatographies, en considérablement amélioré, répondant aux demandes de la recherche et de la production à l'échelle industrielle .