Étude sur le processus de clarification du lysat de fermentation à haute densité d'Escherichia coli recombinant

 

Afin de réduire l'interférence du fluide matériel avec la chromatographie et d'améliorer la récupération de la protéine cible, le processus de clarification du lysat de fermentation à haute densité de deux souches d'Escherichia coli recombinant a été étudié. Les souches BL21-HP1036 et BL21-palA exprimant les gènes clés de Streptococcus suis et Haemophilus parasuis ont été sélectionnées. Le processus de flux tangentiel, le processus de centrifugation à grande vitesse et le processus de clarification par cassette membranaire ont été utilisés pour évaluer le rendement protéique par détection de turbidité et d'électrophorèse.

 

Les résultats ont montré que le lysat de fermentation haute densité BL21-HP1036, BL21-palA exprimant les gènes clés de Streptococcus suis et Haemophilus parasuis ont été clarifiés par filtration sur cassette membranaire et centrifugation, et le rendement protéique était supérieur à 80 %, ce qui pourrait réduire efficacement l'interférence chromatographique et améliorer le taux de récupération.

 

Introduction

Actuellement, Streptococcus suis (SS) et Haemophilus parasuis (HPS) sont les agents pathogènes bactériens les plus courants dans les élevages porcins, ce qui entraîne de lourdes pertes pour l'industrie porcine. SS peut être divisé en un total de 35 sérotypes 1-34 et 1/2, et HPS peut être divisé en sérotypes 1-15, et les deux sont souvent mélangés, provoquant principalement la polysérosite porcine, l'arthrite, la méningite, l'endocardite, la septicémie bactérienne et la bronchite.

 

En raison du grand nombre de sérotypes de Streptococcus suis et d'Haemophilus parasuis, la protection croisée entre les différents sérotypes est faible et la résistance aux antibiotiques augmentera considérablement lors du traitement aux antibiotiques, ce qui affectera l'effet thérapeutique.

 

Les vaccins sont devenus l'un des moyens efficaces de prévention du SS et du HPS. Il existe des vaccins inactivés, des vaccins atténués, des vaccins vivants, des vaccins sous-unitaires et des vaccins génétiquement modifiés, mais les vaccins inactivés et les vaccins atténués sont principalement sur le marché, et leur protection immunitaire est bonne, mais la protection croisée n'est pas évidente. Le vaccin sous-unitaire est un nouveau type de vaccin contre le streptocoque suis, qui est un nouveau type de vaccin avec une forte protection croisée et un prix bas. La recherche et le développement de vaccins sous-unitaires de Streptococcus suis et Haemophilus parasuis offrent une solution parfaite aux problèmes de prévention et de contrôle de Streptococcus suis et Haemophilus parasuis qui affligent l'industrie porcine en Chine.

 

Les vaccins sous-unitaires Streptococcus suis et Haemophilus parasuis sont soumis à une fermentation à haute densité par Escherichia coli recombinant. La clarification du lysat a un effet important sur le rendement des protéines cibles, mais il existe peu de rapports pertinents. La réalisation de l'étape de clarification du processus de fermentation et de purification est un travail important. Dans cet article, la fermentation à haute densité de E. coli recombinant BL21-HP1036, BL21-palA comme objet, pour étudier comment réduire efficacement la turbidité de la solution de clarification, améliorer le rendement en protéines, pour le processus de fermentation du vaccin sous-unitaire Streptococcus suis pour atteindre une technologie de broyage et de clarification industrielle pour fournir une base théorique et un support technique.

 

1. Matériels et méthodes

1.1 Matériaux

 

1.1.1 Souches

Streptococcus suis et Haemophilus parasuis souches BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Principaux milieux et réactifs

Extrait de levure et marsouin ; Chlorure de sodium ; Kanamycine, IPTG ; Formaldéhyde provenant de ; Kit de gel SDS-PAGE.

 

1.1.3 Principaux équipements d’essai

Fermenteur haute densité; Centrifugeuse à grande vitesse; Appareil d'électrophorèse; Système d'imagerie sur gel ultraviolet; Broyeur à ultrasons; Petite centrifugeuse à grande vitesse; Spectrophotomètre ultraviolet; Table à secousses à température constante; Équipement de chromatographie d'affinité.

 

1.2 Méthodes

 

1.2.1 Culture de fermentation à haute densité

Les souches de coliformes recombinantes qualifiées BL21-HP1036 et BL21-pa-lA ont été inoculées sur milieu synthétique à 2% (V/V) et cultivées à 37 degrés pendant 35-40 h.

 

1.2.2 Expression induite par une protéine recombinante

Lorsque la solution de fermentation OD{{0}}±0.1, l'induction a commencé, la température d'induction était de 35 degrés ±0,5 degré et la culture a été terminée après 10 heures d'induction.

 

1.2.3 Broyage homogène et centrifugation à haute pression

Le liquide bactérien ayant passé avec succès le test d'inactivation a été broyé par un homogénéisateur haute pression pour le craquage cellulaire, respectivement, avec une pression de 100 à 150 MPa. Après broyage, le liquide broyé a été conservé à basse température.

Le surnageant a été obtenu par centrifugeuse à grande vitesse, vitesse centrifuge : 1500 tr/min, contrôle de la température : 10 degrés ~ 15 degrés, vitesse d'injection : 0,5 ~ 1 L/min, respectivement, le surnageant a été collecté et le surnageant a été rempli de récipients qui ont éliminé l'endotoxine.

 

1.2.4 Clarification des cassettes à membrane de microfiltration

Français La membrane a été lavée avec 10L d'eau purifiée dans une direction, et une filtration à flux tangentiel a été réalisée. 300 mL de la suspension bactérienne brisée après centrifugation ont été prélevés de la centrifugeuse à canalisation et clarifiés avec une cassette à membrane de microfiltration de 0,45 um. La turbidité a été mesurée par échantillonnage respectivement, et la turbidité après centrifugation, la turbidité du liquide clarifié dans la cassette à membrane de microfiltration et la turbidité du liquide concentré dans la cassette à membrane de microfiltration ont été comparées. La teneur en protéines de l'échantillon a été détectée par chromatographie et électrophorèse pour évaluer le rendement en protéines.

 

Étape 2 : Résultats

2.1 Données de clarification et résultats des tests des protéines BL21-HP1036 et BL21-palA

Les résultats de la figure 1 montrent que la turbidité du fluide de broyage des Escherichia coli recombinants BL21-HP1036 et BL21-palA a diminué de 4 500 NTU et 4 000 NTU à 1970 NTU et 520 NTU, respectivement, après centrifugation en tube. La turbidité des Escherichia coli recombinants BL21-HP1036 et BL21-palA a été réduite à 25 NTU et 1,28 NTU par la méthode de la cassette à membrane de microfiltration. On peut voir que l'utilisation de la filtration à flux tangentiel à cassette à membrane de microfiltration et du canal à flux ouvert optimisé a un bon effet sur la réduction des endotoxines, de la viscosité et de la turbidité du liquide chromatographique que la filtration par centrifugation traditionnelle, et peut réduire de manière significative l'hétéroprotéine et l'acide nucléique E. coli recombinants cassés.

 

2.2 Récupération de protéines des échantillons BL21-HP1036 et BL21-palA

Le tableau 1 montre que la protéine recombinante Escherichia coli BL21-HP1036 existe à la fois dans la solution clarifiée par microfiltration et dans le surnageant concentré recouvert par la membrane de microfiltration, et que le rendement protéique total après récupération de la protéine de la solution clarifiée par microfiltration et du surnageant concentré est d'environ 88,5 %. La protéine BL21-palA existe également dans la solution clarifiée par exsudat de microfiltration et dans le surnageant de la solution concentrée recouverte par la cassette de membrane de microfiltration. Le rendement total de la protéine BL21-PALa était de 81,5 %.

 

3. Conclusion

Dans cet article, les souches exprimant les gènes clés BL{{0}}HP1036 et BL21-palA de Streptococcus suis et Haemophilus parasuis ont respectivement subi une fermentation à haute densité et ont passé 0,45. La turbidité du liquide matériel a été considérablement réduite par le procédé de cassette à membrane de microfiltration um, indiquant que la technologie de filtration à flux tangentiel avec cassette à membrane de microfiltration était meilleure que celle avec centrifugeuse à grande vitesse et pouvait réduire considérablement les protéines d'impureté et l'acide nucléique de l'Escherichia coli recombinant cassé.

 

Français Après avoir recueilli le liquide clair dans la cassette à membrane de microfiltration unique, il y avait 62,9 % Comme 37,1 % de la protéine cible de BL21-HP1036 était un concentré de microfiltration ou existait dans la cassette à membrane de microfiltration et d'autres pertes, une méthode en deux étapes a été adoptée pour la clarification. Dans la première étape, une cassette à membrane de microfiltration de 0,45 um a été utilisée pour clarifier et recueillir l'exsudat ; dans la deuxième étape, le liquide concentré restant a été recueilli après centrifugation en tube, et le liquide clarifié en deux étapes a été combiné comme échantillon chromatographique. La valeur de turbidité du liquide de fermentation BL21-palA n'a pas augmenté de manière significative, le rendement en protéines a pu atteindre plus de 85,5 %, et le rendement en protéines du liquide de fermentation BL21-Pala a pu atteindre 81,5 % après un traitement en deux étapes.

 

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