Principes de base et flux de travail de la synthèse peptidique en phase -solide (SPPS)

Synthèse peptidique en phase-solide (SPPS)est une méthode de synthèse de peptides sur un support solide. Les principales stratégies SPPS comprennentMéthode Bocet leMéthode Fmoc. La synthèse peptidique est un processus répétitif d’addition séquentielle d’acides aminés et est généralement réalisée à partir duC-terminale (extrémité carboxyle)auN-terminus (extrémité aminée). Premièrement, le groupe carboxyle du premier acide aminé du peptide cible est lié de manière covalente à un support solide (résine). En utilisant le groupe amino de cet acide aminé comme point de départ, le groupe protecteur N-terminal est éliminé et la chaîne peptidique en croissance est allongée par réaction avec un excès d'un deuxième acide aminé activé. Ce cycle-couplage → lavage → déprotection → neutralisation et lavage → prochain couplage- est répété jusqu'à ce que la longueur de peptide souhaitée soit atteinte. Enfin, la chaîne peptidique est séparée de la résine et purifiée pour obtenir le peptide cible. Lorsque le groupe -amino est protégé parBoc (tert-butyloxycarbonyle), la méthode est appeléeSynthèse peptidique en phase solide-à base de Boc-. Lorsque le groupe -amino est protégé parFmoc (9-fluorénylméthyloxycarbonyle), on l'appelleSynthèse peptidique en phase solide-à base de Fmoc-.

 

Synthèse peptidique en phase-solide-à base de Boc (méthode Boc)

Dans leMéthode Boc, Groupes Boc éliminables par acide trifluoroacétique (TFA)sont utilisés pour protéger les groupes -amino, tandis quegroupes protecteurs de type benzyle-sont utilisés pour les chaînes latérales. Au cours de la synthèse, un acide aminé - protégé par Boc-est d'abord lié de manière covalente à la résine. Le groupe Boc est ensuite éliminé avec du TFA et l'extrémité amino libre résultante est neutralisée avec de la triéthylamine. L'acide aminé suivant est activé en utilisantDCC (dicyclohexylcarbodiimide)et couplé pour étendre la chaîne peptidique. Une fois l'assemblage terminé, le peptide cible est clivé de la résine à l'aide d'un acide fort, généralementfluorure d'hydrogène anhydre (HF)ouacide trifluorométhanesulfonique (TFMSA).Dans la méthode de synthèse Boc, des traitements acides répétés sont nécessaires pour éliminer les groupes protecteurs avant chaque étape de couplage. Cela peut conduire à plusieurs réactions secondaires, telles qu'un clivage prématuré du peptide de la résine et une instabilité des chaînes latérales d'acides aminés dans des conditions acides, entraînant des réactions secondaires indésirables.

 

Synthèse de peptides en phase solide-à base de Fmoc-(méthode Fmoc)

Dans1978, Meienhofer et Athertondéveloppé une stratégie de synthèse peptidique utilisantFmoc (9-fluorénylméthyloxycarbonyle)comme le -groupe protecteur aminé, connu sous le nom deMéthode Fmoc. Dans cette approche, le groupe -amino est protégé parbase-labile Fmoc, tandis que les chaînes latérales sont protégées pargroupes protecteurs de type acide-labiles Boc-.Un avantage majeur de Fmoc en tant que groupe protecteur amino-est sonstabilité dans des conditions acides; il n'est pas affecté par un traitement avec des réactifs tels queacide trifluoroacétique (TFA)et peut être supprimé de manière sélective à l'aide debase douce. Dans le même temps, les groupes protecteurs de chaîne latérale- tels que Boc sont stables dans des conditions basiques et sont éliminés sous traitement acide. Enfin, le peptide est clivé quantitativement de la résine en utilisantTFA/dichlorométhane (DCM), évitant l'utilisation d'acides forts et améliorant ainsi la sécurité et la compatibilité avec la synthèse peptidique de routine.

 

Historique du développement de la synthèse peptidique en phase-solide (SPPS)

1.Étape fondamentale (du début du 20e siècle à 1963)

Dans1902, Émile Fischera été le premier à explorer la synthèse peptidique, mais les progrès ont été lents en raison de limitations techniques. Premières synthèses utiliséesgroupes protecteurs benzoyle et acétyle, qui étaient difficiles à éliminer et conduisaient souvent àclivage de la chaîne peptidique.

Dans1932, Max Bergmannet mes collègues-ont présenté legroupe benzyloxycarbonyle (Z)en tant que -groupe protecteur aminé. Ce groupe pourrait être supprimé soushydrogénation catalytique ou conditions acides, fournissant un outil plus fiable pour la synthèse peptidique et jetant les bases du développement de la synthèse peptidique-en phase solide dans les années 1960.

Pendant le1950s, les scientifiques ont réussi à synthétiser une variété depeptides biologiquement actifs, tel queocytocine et insuline. Ces réalisations ont fait progresser la chimie des peptides et ont jeté les bases de l'émergence de la synthèse peptidique en phase solide-.

 

2.Étape pionnière (1963)

Dans1963, Robert B.Merrifielda proposé leméthode de synthèse peptidique en phase-solide (SPPS), dans lequel leAcide aminé C-terminalest ancré à un support de résine et la chaîne peptidique est allongée grâce à des cycles répétés dedéprotection et couplage. Cette approche a grandement simplifié le processus de synthèse peptidique et est devenue laméthode préféréepour l'assemblage des peptides.

Merrifield d'occasionBoc (tert-butyloxycarbonyle)pour protéger le groupe -amino. À la fin des années 1960, il développa également lepremier synthétiseur de peptides entièrement automatiséet synthétisé avec succèsprotéines biologiquestel queribonucléase (124 acides aminés). Pour ces réalisations révolutionnaires, Merrifield a reçu le prixPrix ​​Nobel de chimie en 1984.

 

3.Étape d'innovation technologique (1972)

Dans1972, Lou Carpinodéveloppé leGroupe protecteur 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), ce qui peut êtredélicatement retiré dans des conditions basiques, réduisant les réactions secondaires. Cela le rendait particulièrement adapté àpeptides complexesetsynthèse automatisée.

LeMéthode Fmocprogressivement remplacé la méthode Boc comme stratégie dominante. Des synthétiseurs automatisés de peptides basés à la fois surChimie Fmoc et Bocont ensuite été développés, conduisant leautomatisation de la synthèse peptidiqueet améliorant considérablement l'efficacité et la reproductibilité.

 

4. Étape de maturité et d’expansion (des années 1990 à aujourd’hui)

Optimisation des résines et des réactifs :Développement derésines modifiées au PEG-hydrophiles à haute-chargeet des réactifs de couplage efficaces tels queHBTUetHATUa considérablement amélioré l'efficacité et le rendement de la synthèse peptidique en phase-solide (SPPS).

Intégration technologique :De nouvelles approches commesynthèse assistée par micro-ondes-etchimie en fluxont des temps de réaction raccourcis et des rendements encore augmentés.

 

Principes de base et flux de travail de SPPS :
Le principe de base de la synthèse peptidique-en phase solide est leconstruction par étapes d'une chaîne peptidique sur un support solide, en utilisantprotéger les stratégies de groupeetréactions de condensation (couplage)atteindreassemblage peptidique efficace et contrôlable.

1.Rôle du support solide (résine) dans la synthèse peptidique en phase -solide (SPPS)

A résine polymère insoluble-tels quepolystyrène-divinylbenzène-résine réticulée, résine Wang ou résine amide Rink-est sélectionné comme support solide dans SPPS. La surface en résine contientgroupes fonctionnels(par exemple, des groupes hydroxyle ou amino) qui peuvent formerliaisons covalentes avec une extrémité de la chaîne peptidique, généralement leTerminaison C-, ancrant le peptide au support solide. Cette fixation covalente garantit que le peptide en croissancereste lié à la résine tout au long de la synthèse, ce qui grandementfacilite les étapes de réaction ultérieures, le lavage et la purification

 

2. Protéger la stratégie de groupe dans la synthèse peptidique en phase-solide (SPPS)

Lors de la synthèse peptidique, le-groupe aminé, groupe carboxyle et groupes fonctionnels de chaîne latérale réactive-des acides aminés (tels que les groupes thiol, carboxyle et amino) sont sujets àréactions secondaires. Pour éviter ces réactions indésirables,groupes de protectionsont utilisés. Les groupes protecteurs courants comprennent :-Groupes de protection des acides aminés :

Boc (tert-butyloxycarbonyle) :Acide-labile, s'élimine facilement sousconditions acides.

Fmoc (9-fluorénylméthyloxycarbonyle) :Stable dans des conditions acides, peut être éliminé sousconditions de base(par exemple, solution pipéridine/DMF).Groupes de protection de chaîne latérale :Sélectionnés en fonction des propriétés chimiques de la chaîne latérale des acides aminés. Les groupes communs comprennentbenzyle (Bn), tert-butyle (tBu), trityle (Trt), etc. Ces groupes sontsupprimé en fin de synthèse, généralement lors du clivage du peptide de la résine, en utilisantacide ou autres conditions spécifiques.

 

3.C-Synthèse du terminus à N-terminal dans SPPS

Danssynthèse peptidique en phase-solide (SPPS), l’assemblage des peptides commence généralement auC-terminale (extrémité carboxyle)et procède par étapes vers leN-terminus (extrémité aminée). C'est parce que leL'acide aminé C-terminal est d'abord attaché au support solide, et les acides aminés suivants sont couplés augroupe amino libre de la chaîne peptidique déjà lié à la résine, allongeant progressivement la chaîne peptidique.

 

4.Réaction de couplage en synthèse peptidique en phase -solide (SPPS)

Les acides aminés protégés doivent êtreactivépour que leurles groupes carboxyle deviennent réactifs, leur permettant de former unliaison peptidiqueavec le groupe amino du peptide lié à la résine-. Communréactifs activateursinclurecarbodiimides(par exemple, DCC, DIC),HOBt, HATU, etPyBOP. Une fois activé, le groupe carboxyle réagit avec le groupe amino libre de manièreréaction de condensation, formant unliaison amideet attachant ainsi le nouvel acide aminé à la chaîne peptidique en croissance.

 

5.Opérations répétitives (cycliques) en synthèse peptidique en phase -solide (SPPS)

Le processus impliquerépéter le cycle de déprotection → couplage → lavage, en ajoutantun acide aminé par cyclepour allonger progressivement la chaîne peptidique. Après chaqueréaction de couplage, la résine estlavé(par exemple, avec des solvants tels que le DMF ou le DCM) pour éliminer les réactifs n'ayant pas réagi, les sous-produits - et les acides aminés en excès. Le-le groupe amino du résidu nouvellement ajouté est ensuite déprotégé, exposant une amine libre pour préparer la prochaine réaction de couplage. Ce cycle est répété jusqu'à ce que la séquence peptidique souhaitée soit entièrement assemblée.

 

6.Clivage en synthèse peptidique en phase -solide (SPPS)

Une fois que la chaîne peptidique a atteint la longueur désirée, elle estclivé du support solideen utilisant un réactif approprié, tout ensupprimer tous les groupes protecteurs. Un réactif de clivage couramment utilisé estacide trifluoroacétique (TFA), ce qui non seulementrompt le lien entre le peptide et la résinemais aussisupprime les groupes protecteurstels que Fmoc et Boc, rétablissant le peptide à sonÉtat d'origine. Une fois que la chaîne peptidique a atteint la longueur désirée, elle estclivé du support solideen utilisant un réactif approprié, tout ensupprimer tous les groupes protecteurs. Un réactif de clivage couramment utilisé estacide trifluoroacétique (TFA), ce qui non seulementrompt le lien entre le peptide et la résinemais aussisupprime les groupes protecteurstels que Fmoc et Boc, rétablissant le peptide à sonÉtat d'origine.

Grâce à ces étapes,synthèse peptidique en phase-solide (SPPS)permet à laassemblage efficace et contrôlé de chaînes peptidiques sur un support solide, évitant les étapes de purification intermédiaires compliquées requises dans la synthèse traditionnelle en phase de solution-et, de manière significativeaméliorer l'efficacité et le rendement de la synthèse.

Grâce à ces étapes,synthèse peptidique en phase-solide (SPPS)permet à laassemblage efficace et contrôlé de chaînes peptidiques sur un support solide, évitant les étapes de purification intermédiaires compliquées requises dans la synthèse traditionnelle en phase de solution-et, de manière significativeaméliorer l'efficacité et le rendement de la synthèse.