Étude sur l'application de la filtration en profondeur dans le processus de production du vaccin contre la fièvre aphteuse
Préface - Qu'est-ce que la fièvre aphteuse
Au 14ème siècle, il existe des traces écrites d'une fièvre aphteuse similaire en Europe. La fièvre aphteuse est une maladie aiguë, fébrile et très contagieuse causée par le virus de la fièvre aphteuse.
Les symptômes cliniques des animaux adultes comprennent : une augmentation de la température corporelle, des ampoules et des ulcérations dans la bouche, des ampoules et des ulcérations dans le sabot, et même la perte de la coquille du sabot, entraînant des difficultés à manger et à dormir, une perte de poids et même une perte de valeur économique chez les animaux économiques. ;
Les symptômes cliniques des jeunes animaux comprennent : une température corporelle élevée, une myocardite et d'autres symptômes. Une fois apparus, les jeunes animaux ont une mortalité élevée.
Abstrait
Au cours des 500 dernières années, la fièvre aphteuse s'est déclarée à plusieurs reprises dans le monde et un grand nombre de porcs, de bovins, de moutons et d'autres animaux domestiques ainsi que d'ongulés sauvages à doigts égaux sont morts ou sont tombés malades, ce qui a eu de graves conséquences sur le bétail. et l'industrie de l'élevage.
Afin d'étudier l'application de la technologie de filtration en profondeur dans le processus de production du vaccin contre la fièvre aphteuse, les performances de filtrabilité de la filtration en surface et de la filtration en profondeur ont été testées et comparées, ainsi que l'effet protecteur sur la filtration bactéricide. Les avantages de la filtration en profondeur à haute charge pour l'élimination des débris cellulaires ont été étudiés. Les schémas de filtration correspondants pour des milieux de culture cellulaire présentant différentes turbidités ont été analysés.
Les résultats ont montré que la charge de filtration en profondeur était 13,9 fois supérieure à celle de la filtration de surface, que la turbidité du liquide filtrant ne représentait que 23,5 % de celle de la filtration de surface et que la charge de débactérisation ultérieure de 0,2 um était 7,2 fois supérieure à celle de la filtration de surface. filtration superficielle. En utilisant son ligand résine spécial, la turbidité du liquide filtrant est de 38,6 % de celle du filtre profond ordinaire avec la même taille de pores, ce qui est bénéfique pour protéger le processus en aval. Les résultats ont montré que la filtration en profondeur, en particulier la filtration en profondeur à charge positive forte, pourrait être appliquée efficacement à la production de vaccin contre la fièvre aphteuse, et que des processus de filtration appropriés devraient être établis pour différents milieux de culture.
Fièvre aphteuse et filtration en profondeur
La fièvre aphteuse (FMD) est une maladie aiguë, fébrile et contagieuse des animaux ongulés causée par le virus de la fièvre aphteuse (FMDV). Les animaux les plus sensibles à cette maladie sont les bovins, les porcs et les moutons. La fièvre aphteuse est endémique en Asie, en Afrique, au Moyen-Orient et en Amérique du Sud, avec une incidence très élevée et une transmission rapide. L'Organisation mondiale de la santé animale (OIE) la classe comme première maladie zoonotique de catégorie A, obligeant les États membres à inclure la fièvre aphteuse dans la liste des maladies animales à déclaration obligatoire. La vaccination est un moyen efficace de prévention spécifique de la fièvre aphteuse. Le vaccin inactivé contre la fièvre aphteuse, fabriqué en inactivant le virus intact avec un inactivateur, joue un rôle important dans la prévention et le contrôle de la fièvre aphteuse.
L’antigénicité du FMDV lui-même est médiocre et l’inactivation du virus a un impact important sur son antigène. Par conséquent, dans la production actuelle de vaccin contre la fièvre aphteuse, un vaccin contre la fièvre aphteuse de haute pureté peut garantir la teneur en antigène et la pureté de la dose unitaire, ce qui est particulièrement important et constitue également la stratégie de vaccination actuelle. Cela impose des exigences élevées en matière de purification des virus en aval. En outre, avant 2009, les vaccins inactivés contre la fièvre aphteuse en amont en Chine adoptaient principalement la méthode de culture consistant à faire tourner la bouteille et à la coller au mur. Avec la demande croissante de vaccins, les inconvénients de cette méthode de culture nécessitant un grand nombre de flacons rotatifs, une faible efficacité et un faible niveau d'expression sont progressivement apparus.
Par conséquent, ces dernières années, la technologie de culture cellulaire a lentement évolué de la culture adhérente précédente à la culture en suspension, et la production de virus a été considérablement améliorée. Cependant, avec l'augmentation de la production virale, le changement de mode de culture a exercé une plus grande pression sur la purification en aval, car les débris cellulaires générés par le processus de culture, la libération cellulaire des protéines de l'hôte, de l'ADN de l'hôte, etc., ont augmenté en conséquence, ce qui a augmenté en conséquence. impose des exigences supplémentaires en matière de capacité de purification en aval.
La technologie de filtration sur membrane est largement utilisée dans le processus de production de produits biologiques tels que les vaccins, parmi lesquels la technologie de filtration DC est généralement utilisée dans le processus de récolte du venin de maladie pour séparer les impuretés insolubles telles que les débris cellulaires. Lors des premières clarifications du FMDV, la technologie de filtration de surface représentée par l'élément filtrant à membrane pliable a été principalement adoptée. Avec le changement des conditions de culture, l'augmentation des impuretés des débris cellulaires, la filtration de surface est difficile à obtenir l'effet de clarification, et parce que la charge de filtration de surface est faible, le coût des matériaux filtrants devient de plus en plus élevé.
Dans le contexte ci-dessus, la filtration en profondeur a été de plus en plus appliquée dans le processus de séparation cytoliquide du FMDV. Le matériau filtrant profond est généralement composé de fibres longues et fines provenant de sources naturelles, et le canal formé par le média filtrant après avoir formé un film est souvent très tortueux, semblable à la structure de l'ouverture du labyrinthe. Les particules d'impuretés sont souvent piégées à l'intérieur du filtre plutôt qu'à la surface. De plus, la paroi du canal filtrant absorbe souvent une partie des impuretés extrêmement fines par action électrostatique ou force intermoléculaire. En général, le mécanisme de filtration en profondeur est caractérisé par une rétention mécanique et une adsorption.
Méthode de filtration à courant constant
Installez la plaque filtrante profonde sur le dispositif de filtrage à courant constant, lavez la plaque filtrante avec un tampon PBS au-dessus de 54 L/m2 ; Une fois le lavage terminé, démarrez la pompe péristaltique pour pomper lentement le liquide, ajustez lentement la vitesse de la pompe à peu près au débit attendu et filtrez le liquide. Enregistrez le volume de filtration, la durée, la différence de pression et la turbidité pendant le processus de filtration. Le filtrat a été collecté pour la détection de l'antigène.
Avantages de la filtration en profondeur
La filtration de surface est une technologie qui capture les particules à la surface du matériau filtrant pour réaliser la filtration. Le mécanisme de filtration repose principalement sur la taille des particules dans le tamis liquide, les grosses particules sont piégées à la surface de la membrane filtrante. La filtration en profondeur utilise des canaux internes pour l'interception et l'adsorption des particules en profondeur. Le diagramme comparatif des deux est présenté à la figure 1.
La solution inactivée du vaccin contre la fièvre aphteuse d'un certain fabricant a été pré-filtrée respectivement par une membrane de surface en polypropylène de 0,45 um et une plaque filtrante profonde, puis filtrée par un filtre bactéricide de 0,2 um. Les données de filtrabilité sont présentées dans le tableau 1.
La turbidité de la solution inactivée du vaccin contre la fièvre aphteuse est de 77 NTU. Si la bactérie est filtrée directement, un grand nombre de fragments cellulaires entraîneront inévitablement le blocage rapide de la membrane filtrante 0.2um, ce qui affectera la transmission des viparticules 146S. Par conséquent, la préfiltration a été conçue avant la filtration de débactérialisation, et les deux méthodes de préfiltration, à savoir la filtration en profondeur et la filtration en surface, ont été comparées. La plaque filtrante profonde à double couche est sélectionnée pour la filtration, la charge est de 641 L/m2 et le filtre profond réduit le matériau de 77 NTU à 9,65 NTU, ce qui est clair et brillant. La charge de filtration de surface de 0,45 um n'est que de 46 L/m2 et la turbidité du liquide filtrant atteint 41 NTU, ce qui ne convient pas à la pré-filtration. Selon la comparaison de la charge de filtration débactérialisée suivante 0.2um, la charge de membrane de filtration débactérialisée après filtration en profondeur est de 655 L/m2, soit 7,2 fois la charge de filtration de surface correspondante (seulement 91 L/m2) .
Les résultats des tests 146S montrent que le rendement du système de filtration en profondeur est supérieur à celui du système de filtration en surface. La charge de filtration en profondeur était 13,9 fois supérieure à celle de la filtration de surface, la turbidité du liquide filtrant n'était que de 23,5 % de celle de la filtration de surface, et la charge de filtration ultérieure 0,2 um pour éliminer les bactéries était 7,2 fois celle du filtration superficielle. Par conséquent, tant du point de vue du coût que du point de vue du rendement, le système de filtration en profondeur est nettement meilleur que le système de filtration par membrane de surface.
Avantages du filtre profond à forte charge positive
La plaque filtrante profonde à charge positive et la plaque filtrante profonde à charge positive forte ont été utilisées pour comparer la solution inactivée du vaccin contre la fièvre aphteuse provenant de différentes sources. Les résultats de filtrabilité sont présentés dans le tableau 2, et le changement de vitesse de filtration et la différence de pression dans le processus de filtration sont présentés dans la disposition des couleurs 2.
Les deux groupes de plaques filtrantes profondes utilisés ont la même précision d'ouverture, et les performances sont très cohérentes du point de vue du changement de charge et de différence de pression, et la courbe de changement de différence de pression de la figure 2 est fondamentalement identique.
Cependant, du point de vue de la turbidité du liquide filtrant, la différence est très grande. Le liquide filtrant de la plaque filtrante double couche ordinaire chargée positivement est de 25 NTU, tandis que le liquide filtrant de la plaque filtrante profonde fortement chargée positivement avec la même ouverture n'est que de 9,65 NTU, soit seulement 38,6 % de la plaque filtrante profonde ordinaire. Cela est principalement dû au ligand de résine spécial présent dans le matériau filtrant à plaque filtrante profonde à forte charge positive. La turbidité est réduite à moins de 10NTU grâce à la plaque filtrante à double couche fortement positive, et les fragments cellulaires sont entièrement adsorbés ou piégés, ce qui favorise le processus d'ultrafiltration ou de filtration bactéricide ultérieur. En plus de l'effet d'adsorption sur les débris cellulaires insolubles, Yigzaw Y et al ont également signalé l'effet d'élimination d'une plaque filtrante profonde fortement chargée positivement sur la protéine hôte cellulaire, et Dorsey N et al ont rapporté l'effet d'élimination d'une plaque filtrante profonde fortement chargée positivement. sur l'ADN.
Mise en place d'un procédé de filtration de clarification du surnageant du vaccin contre la fièvre aphteuse par filtration profonde
Grâce à l'étude comparative ci-dessus de la filtration en surface et de la filtration en profondeur, et à l'étude de l'effet de clarification de la plaque filtrante profonde spéciale à forte charge positive, différents schémas de filtration devraient être adaptés au surnageant inactivé du vaccin contre la fièvre aphteuse produit sous différents conditions de culture. Pour le surnageant centrifuge avec 3 turbidités différentes, faible turbidité, turbidité moyenne et turbidité élevée, le schéma de filtration en profondeur et les paramètres de filtration correspondants sont présentés dans le tableau 3.
Pour le surnageant centrifuge à faible turbidité, la plaque filtrante profonde monocouche peut clarifier et éliminer efficacement une petite quantité de débris cellulaires. Pour le surnageant centrifuge de turbidité moyenne, la plaque filtrante profonde à double couche peut clarifier efficacement, en particulier la plaque filtrante profonde à forte charge positive peut réduire la turbidité à moins de 5 NTU ; Pour le surnageant centrifuge avec une turbidité plus élevée, la plaque filtrante combinée peut être efficacement clarifiée. Quel que soit le processus, la capacité de traitement est de 500 à 800 L/m2, la turbidité du liquide filtrant est inférieure à 20 NTU et l'antigène cible est entièrement récupéré, adapté à une production à grande échelle.
Discussion
Dans les années 1970, il a été spécifié que les médias filtrants ne devaient pas utiliser de matériaux contenant de l'amiante, en raison de la présence de substances cancérigènes dans les matériaux contenant de l'amiante. Le matériau filtrant en profondeur ne contient pas d'amiante et possède une charge positive plus forte. Le matériau filtrant est composé d'une matrice de fibres de bois et d'un adjuvant de filtration. Dans le processus de production, la résine polymère est utilisée pour relier les composants de base, et les groupes fonctionnels de charge positive qu'elle contient confèrent efficacement la capacité d'adsorption de charge du matériau filtrant en profondeur. L’excellente performance de la filtration profonde adsorbante sur la capacité de capture des particules fines est illustrée à la figure 3.
Dans cette expérience, différents composants de résine et différents matériaux de filtration profonde de précision ont été sélectionnés pour clarifier le test de filtration de la solution de culture FMDV, et le test de comparaison a été effectué avec filtration de surface. Les résultats ont montré que la filtration en profondeur était plus adaptée à l'élimination des débris cellulaires que la filtration en surface, ce qui était propice à l'unité de filtration ultérieure avec contrôle de la charge microbienne (0,2 um). De plus, en comparant l'effet de filtration de la plaque filtrante profonde à charge positive forte et de la plaque filtrante profonde à charge positive ordinaire, la plaque filtrante à charge positive forte montre une forte capacité de contrôle de la turbidité, ce qui peut réduire la turbidité à moins de 5 NTU, ce qui est très propice à l’amélioration de la robustesse de l’ensemble du processus de filtration.
Le processus de culture en amont a une grande influence sur les étapes de récolte des principes actifs. Grâce à des tests, cette expérience a finalement établi un schéma de filtration évolutif pour les milieux de culture cellulaire avec différentes turbidités, ce qui revêt une certaine importance pour la production à grande échelle.
Le filtre en profondeur qui sera lancé par Guidling Technology est un élément filtrant de type disque, qui est une sorte d'élément filtrant efficace avec un carton filtrant profond comme matériau filtrant, répondant pleinement aux exigences réglementaires du secteur biopharmaceutique, principalement conçu et fabriqué spécifiquement pour l'élimination des des contenus solides importants tels que des cellules et des fragments cellulaires, et peuvent être appliqués à un fluide de culture cellulaire de mammifère ; Clarification du lysat de bactéries et de cellules de levure ; Élimination de la protéine de la cellule hôte (HCP) ; Supprimez le virus et le DN ; Élimination des endotoxines ; La suppression de l'antimousse.
Le produit présente les avantages d'un petit volume mort, d'une amplification linéaire, d'une structure de capsule de disque, d'une conception de structure compacte et peut être utilisé en série avec d'autres équipements, d'un faible encombrement, d'un débit stable, d'une longue durée de vie et d'un faible coût.
