Partager de la littérature|Dites adieu à la purification complexe? Une nouvelle méthode de surfactant TFF + améliore l'efficacité et réduit les coûts dans la production de vecteurs AAV
La thérapie génique se développe rapidement, mais son coût élevé reste un obstacle majeur prévenant un accès plus large des patients. Parmi les principaux moteurs de ce coût, il y a le processus de production complexe des vecteurs Adeno - Virus associés (AAV). Une étude publiée en biotechnologie et bio-ingénierie a développé une nouvelle méthode de purification combinant la filtration d'écoulement tangentielle (TFF) avec des tensioactifs, qui promet de simplifier le processus de purification AAV et de réduire les coûts. Plongeons cette recherche dirigée par une équipe de l'Université de Tokyo.
1. Contexte de recherche: défis et état actuel de la purification AAV
Les vecteurs AAV sont devenus des outils d'administration "étoiles" en thérapie génique en raison de leur forte sécurité, de leur faible immunogénicité, de leur capacité à infecter les cellules divisées et non - et la capacité de l'expression des gènes du terme long -. Cependant, leur processus de production est complexe, en particulier les étapes de purification en aval, qui impliquent généralement plusieurs cycles de centrifugation et de chromatographie. Ces méthodes sont du temps - consommant, travail - intensive, difficile à évoluer et coûteuse.
À l'échelle de laboratoire, la purification repose souvent sur un chlorure de césium ou une ultracentrifugation du gradient de densité d'iodixanol, ce qui est difficile à évoluer pour la production industrielle. La chromatographie sur l'affinité est de plus en plus utilisée, mais les conditions d'élution de pH faibles dont elle nécessite peuvent altérer l'infectiosité virale. Par conséquent, le développement d'une méthode de purification AAV simple, efficace, douce et évolutive est essentiel.
La filtration de flux tangentiel (TFF) est une technique de séparation basée sur la taille - couramment utilisée pour concentrer et tampon - échange de bioproduits. Cependant, le TFF conventionnel a une capacité limitée à éliminer les impuretés telles que les protéines des cellules hôtes (HCP) et l'ADN pendant la purification AAV, laissant souvent des agrégats de protéines derrière.
2. Approche innovante: TFF combiné avec des tensioactifs pour une purification efficace
Pour surmonter les limites du TFF traditionnel, les chercheurs Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa et les collègues de l'Université de Tokyo ont conçu une stratégie intelligente: en utilisant des tensioactifs pour inhiber l'agrégation et l'interaction des protéines d'impureté, leur permettant de passer par le TFF Ultrafiltration Irgo taille).
Ils ont testé trois types de surfactants:
- Non - ionic:Glucoside d'octyle
- Anionic:Désoxycholate de sodium
- Zwitterionic:Gars
L'étude a révélé que l'utilisation d'un tensioactif ionique non - seul était inefficace. Le désoxycholate anionique de sodium et les chaps zwitterioniques ont considérablement amélioré l'élimination des protéines résiduelles, et ils ont ciblé différentes populations de protéines. En fin de compte, la combinaison de désoxycholate de sodium à 0,5% avec 1% a produit des résultats remarquables, éliminant presque complètement les protéines hôtes résiduelles. L'analyse des pages SDS - n'a montré que les trois bandes protéiques de capside AAV claires (VP1 / VP2 / VP3).
Figure 1. Processus de purification TFF sans tensioactifs;(a) SDS - Page Gel Electrophorèse; (b) microscopie électronique à transmission (TEM)
Figure 1. Processus de purification TFF avec des tensioactifs;(a) SDS - électrophorèse sur gel de la page; (b) microscopie électronique à transmission (TEM)
3. Résultats de la recherche: haute pureté, activité et sécurité
- Élimination efficace des impuretés:La nouvelle méthode a obtenu une suppression de 99,98% des HCP et une élimination à 95% de l'ADN, avec une pureté comparable ou dépassant celle de la chromatographie d'affinité.
- Infectiosité améliorée:Des expériences in vitro ont montré que les vecteurs AAV1 ont purifié en utilisant cette méthode infecté les cellules HEK293 plus efficacement que celles purifiées par chromatographie d'affinité (24,9% vs 20,8%), indiquant une meilleure préservation de la bioactivité virale.
- Bonne sécurité in vivo:Après l'injection locale de vecteurs AAV1 purifiés dans le muscle squelettique de la souris, aucune inflammation ou lésion tissulaire significatif n'a été observé après deux semaines, démontrant une bonne sécurité in vivo.
- Applicabilité de sérotype large:La méthode a purifié avec succès plusieurs sérotypes -, y compris les surnageants de culture cellulaire AAV1, AAV5, AAV8 et AAV9-from. Cependant, pour AAV2, qui existe principalement dans les lysats cellulaires à forte charge d'impureté, une optimisation supplémentaire est nécessaire.
4. Résumé et perspectives
Cette étude a développé un nouveau processus de purification AAV simple, rapide (1,5 heures), efficace et évolutif. En combinant le désoxycholate de sodium et les chaps, il a réussi à relever le défi de l'agrégation des protéines résiduelles pendant la purification TFF.
Les avantages de la méthode comprennent:
- Éviter les conditions du pH faibles durs, mieux préserver l'activité virale
- Réduire les étapes de chromatographie, simplifier le flux de travail et économiser du temps et des coûts
- Facilement évolutif, adapté à la production industrielle de grande-
- Fournir une nouvelle stratégie pour purifier d'autres biomacromolécules telles que les exosomes, d'autres virus et les anticorps recombinants
Les limitations actuelles incluent la récupération virale sous-optimale et l'incapacité de séparer les capsides vides des particules virales complètes, ce qui suggère que sa meilleure utilisation peut être une première capture de pas - dans un flux de travail de purification multi -.
En conclusion, cette recherche offre une nouvelle option attrayante pour la production de vecteurs AAV en aval et a le potentiel de réduire considérablement le coût des médicaments de thérapie génique, facilitant leur application plus large.