Résumé:

Cet article passe en revue deux facteurs clés qui doivent être pris en compte dans les stratégies de purification des protéines: les exigences d'application en aval et les caractéristiques biologiques des protéines elles-mêmes. L'article souligne que la purification des protéines de haute qualité est le fondement de la fiabilité et de la répétabilité des données expérimentales, en particulier pour la production de protéines recombinantes. Différents scénarios d'application ont des exigences spécifiques pour la pureté des protéines, l'activité ou la teneur en endotoxine, et les caractéristiques des protéines peuvent affecter considérablement les stratégies de purification. Selon des cas spécifiques, l'article illustre que les protéines uniques devraient adopter des schémas de purification personnalisés. Enfin, un processus systématique de production de protéines a été proposé (figure 1), mettant l'accent sur le contrôle de la qualité du processus complet à partir de la sélection des systèmes d'expression, de la conception de la construction à l'optimisation de la purification et de la recommandation de l'évaluation de l'homogénéité des protéines et des fonctionnalités par le biais de techniques biophysiques (telles que SEC-Mals, DSF, etc.). Cet article vise à fournir des conseils pratiques aux chercheurs, en les aidant à formuler des stratégies de purification efficaces et reproductibles basées sur les caractéristiques et les exigences d'application des protéines cibles, améliorant ainsi la qualité et l'efficacité de la recherche scientifique.

 

Figure 1. Diagramme schématique du processus de production de protéines

 

Production de protéines à haute demande - Exemples d'identification des problèmes, de conception de stratégie d'atténuation et de sortie correspondante

 

1. liaison de l'acide nucléique aux protéines:

Lors de la purification des protéines de liaison à l'acide nucléique, plusieurs étapes sont nécessaires pour éliminer la contamination de l'acide nucléique. Pendant la lyse, les nucléases (telles que la nucléase SM (benzonase®) ou la DNase ou la RNase) doivent être ajoutées, mais les acides nucléiques liés ne peuvent pas être complètement éliminés. Remplacez les étapes d'élimination de l'acide nucléique, telles que les précipitations de sulfate de PEI ou de streptomycine, la purification de l'héparine ou la chromatographie d'échange d'ions. La présence d'acides nucléiques a été surveillée par le rapport d'A26 0 nm \/ a28 0 nm tout au long du processus de purification. Si le rapport était inférieur à 0,6, il a indiqué que la pureté des protéines était relativement élevée et que la contamination de l'acide nucléique était minime. Pour les protéines avec des acides nucléiques fortement liés, ils peuvent être temporairement dénaturés (tels que traités avec de l'urée) puis renaturés. Points clés: Utilisez des réactifs de haute qualité, des tampons frais et des colonnes propres (nettoyer avec 0,5 m de NaOH avant utilisation).

 

2. Chaîne lourde de la ferritine de souris:

Le but de produire la protéine purifiée de la chaîne lourde de la ferritine de souris (MFTH1) est la microscopie cryo-électron à haute particularité à haute résolution (cryo-EM). Le vecteur d'expression d'Escherichia coli codé MFTH1 non marqué a été perturbé par ultrasons sans ajouter de nucléase. Après chauffage à 7 0, il a subi des précipitations de sulfate d'ammonium, des étapes de chromatographie d'exclusion de dialyse et d'exclusion de taille. L'échantillon résultant a montré la présence d'une grande quantité de contaminants dans les images de microscopie cryo-électron (figure 2A), ce qui était complètement inadapté à son application. Optimiser les étapes. Ajouter la nucléase SM pendant le processus de lyse cellulaire et le processus de dialyse après précipitation au sulfate d'ammonium, puis ajouter l'étape de chromatographie d'échange d'anions pour réduire le rapport de A26 0 nm \/ a280 nm de 1,4 à 0,8. Après la chromatographie d'exclusion de taille, le rapport de A260 Nm \/ A280 Nm de l'échantillon MFTH1 final était de 0,56. Les images de microscopie SDS-PAGE et cryo-électrons (figure 2B) ont montré que la protéine était très pure, indiquant que les contaminants avaient été efficacement retirés.

Figure 2 Chaîne lourde de la ferritine de souris

 

 

 

3. DSRBEC humain de la protéine chimérique (DSRBD-EGF-chimera):

Le DSRBEC est formé par la fusion du domaine de liaison à l'ARN double brin (DSRBD) de la protéine kinase H humaine et du facteur de croissance épidermique humain (HEGF). Lorsque le DSRBD est exprimé dans Escherichia coli, il montre une capacité de liaison à l'ARNdb extrêmement élevée. Après lyse cellulaire, l'ARN contaminant entravera la liaison des protéines recombinantes à la colonne de chromatographie sur l'affinité des ions métalliques (IMAC). Des méthodes conventionnelles telles que les précipitations du sulfate de l'EPI ou de la streptomycine, le traitement de la RNase ou les solutions tampons à sel ne peuvent pas éliminer l'ARN. La lyse cellulaire a été réalisée en utilisant un tampon contenant 4 m d'urée. Le surnageant a été chargé sur une colonne IMAC, et 4M à 0 m urée a été lentement utilisé pendant la nuit (Renaturation de la colonne). Le tampon de renaturation a été ajouté avec l'imidazole et élué de la colonne IMAC. Le raffinement final a été réalisé par la filtration du gel Superdex 75 pour obtenir du DSRBEC fonctionnellement actif.

 

4. Protéines liées à des cations divalents ou à d'autres cofacteurs:

Pour les protéines qui interagissent avec des cations divalents telles que Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, ou d'autres cofacteurs, il est crucial d'ajouter des cations divalents spécifiques (ou d'autres cofacteurs) pendant l'expression. Une petite quantité des mêmes cations divalents (ou d'autres cofacteurs) est également requise pendant le processus de purification. Cependant, l'utilisation de tous les agents chélateurs (tels que l'EDTA, l'EGTA) et les agents réductrices chélateurs (tels que le DTT ou le DTE) doivent être évités. Lorsqu'il s'agit de protéines liées à des cations divalents, un mélange d'inhibiteurs de protéase sans agents chélateurs doit être utilisé pour confirmer la présence réelle de cations divalents (ou d'autres cofacteurs) dans la protéine purifiée par des méthodes spectroscopiques (telles que la spectrophotométrie d'absorption atomique).

 

5. Ferridoxine recombinante (RFD) contenant un seul groupe [2Fe ± 2S] de cyanobactéries thermophiles mastigocladus laminosus

La ferridoxine est une protéine fer-soufre soluble qui participe à des réactions de transfert d'électrons. La ferrorenoxine de type végétal porte un seul groupe [2Fe ± 2S] en tant qu'accepteur d'électrons du photosystème I. La souche Escherichia coli BL21 (DE3) a exprimé la protéine RFD recombinante dans le milieu TB contenant 10 mm FECL3 et les antibiotiques. L'élution de la colonne de capture de l'iMAC a été réalisée en utilisant un tampon contenant 10 mm d'histidine pour éviter l'imidazole et empêcher la destruction de l'amas [2Fe ± 2S]. L'échange d'anions et la chromatographie d'exclusion de taille ont été utilisés pour une purification et une concentration supplémentaires à 12 mg \/ mL pour le dépistage de la cristallisation. Par rapport à la production recombinante de ferrorenoxine, la ferrorenoxine naturelle purifiée à partir des algues bleu-vert mastigocladus laminosus a atteint une résolution plus élevée pendant la cristallisation.

 

6. Protéines utilisées comme antigènes

Les protéines sont souvent utilisées comme antigènes pour récupérer les ligands spécifiques de la cible. La première chose à considérer est de savoir si la protéine est utilisée pour l'immunité in vivo pour obtenir des IgG monoclonales ou polyclonales conventionnelles, ou pour des programmes impliquant des IgG de chameau ou des processus de sélection in vitro.

 

6.1 antigènes utilisés pour la production d'anticorps de routine

Lorsque les antigènes sont utilisés pour produire des anticorps IgG monoclonaux, le repliement correct de l'antigène n'est généralement pas nécessaire, car la plupart des anticorps monoclonaux reconnaissent les épitopes linéaires qui ne sont pas très affectés par la structure de l'antigène, et même les antigènes dénaturés (comme les protéines du corps d'inclusion) restent efficaces. Cependant, la pureté doit être strictement contrôlée pour éviter de forts contaminants immunogènes interférant avec la réponse immunitaire et provoquant la domination des anticorps non cibles.

 

6.2 PRÉCESSION DE LA BIBLIOTHÈQUE CONFIGATE

Une attention particulière doit être accordée au maintien de la conformation naturelle de l'antigène lors du traitement de la bibliothèque nanobody obtenue par vaccination par camel. Contrairement aux anticorps conventionnels, les anticorps de chameau (en particulier les nanobes) ont tendance à reconnaître les épitopes structurels, qui sont liés à leur structure de site complémentaire convexe unique. De même, lors du dépistage de grandes bibliothèques d'anticorps synthétiques ou naturelles in vitro, l'antigène doit maintenir une structure qui est complètement cohérente avec l'application cible. Étant donné que le processus de dépistage lui-même n'est pas biaisé, si l'antigène a un mauvais repliement, une agrégation ou une hétérogénéité conformationnelle, un grand nombre de conjugués ciblant les épitopes non naturels peuvent être dépistés.

 

 

 

7. Protéines contenant des liaisons disulfure intermoléculaires ou intramoléculaires ou de la cystéine libre

Les liaisons disulfures sont cruciales pour stabiliser la structure naturelle des protéines. Pendant le processus de purification, lors de la purification des protéines contenant des liaisons disulfure intermoléculaires ou intramoléculaires, il est nécessaire d'éviter d'ajouter des agents réducteurs pour éviter les changements conformationnels des protéines, modifiant ainsi leurs fonctions. Pour les protéines contenant de la cystéine libre, les agents réducteurs sont indispensables à toutes les étapes du processus de purification, en particulier pendant le stockage, pour empêcher la formation de liaisons disulfure artificielles. Les agents réducteurs les plus couramment utilisés sont le dithiothréitol (dtt), -mercaptoéthanol (-me) et Tris (2- carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP). Pour les résines IMAC qui sont incompatibles avec DTT ou TCEP, il est recommandé d'utiliser -ME et de les remplacer par d'autres agents de réduction dans les étapes suivantes.

 

8. Fragment d'anticorps recombinant

Bien que la structure des fragments d'anticorps recombinants (comme les nanobodies) soit plus simple que celle de l'IgG, leur fonction dépend de la formation correcte de liaisons disulfure. Dans les systèmes d'expression bactérienne, même avec l'adoption de stratégies d'optimisation, des produits mal repliés ou partiellement pliés peuvent encore se produire, qui existent à la fois dans la partie soluble et dans le corps d'inclusion. Plus caché est que même les fragments d'anticorps pliés correctement peuvent former des agrégats solubles (agrégation colloïde) par des plaques hydrophobes à la surface. Ces agrégats sont difficiles à identifier dans les tests fonctionnels de routine (tels que ELISA) car la liaison multivalente peut masquer la baisse de l'affinité des monomères, mais leur présence peut sérieusement affecter les applications qui reposent sur la taille des petites molécules (comme la microscopie à super-résolution). Par conséquent, le fait de s'appuyer uniquement sur SDS-PAGE est insuffisant pour évaluer la qualité de l'échantillon. Des méthodes biophysiques telles que la filtration du gel (figure 3) doivent être adoptées pour distinguer les monomères (pics principaux) des agrégats (pics de volume d'exclusion). Les points de contrôle clés comprennent: l'optimisation de l'environnement redox pendant l'expression pour favoriser la formation de liaisons disulfure et l'optimisation des conditions de stockage après purification pour éviter l'agrégation. Ces mesures sont cruciales pour assurer la monodispersité et la fonction des fragments d'anticorps.

Figure 3. Séparation de filtration sur gel des agrégats solubles des nanobodies

 

9. Fragments solubles du récepteur des lymphocytes LLT1

L'expression recombinante des protéines dépendant de la liaison disulfure (telles que le récepteur des lymphocytes LLT1) fait face à des difficultés de repliement. La filtration sur gel du LLT1 de type sauvage a montré des pics d'agrégation et des pics de dimère (figure 4A), mais la spectrométrie de masse a révélé un mauvais repliement causé par la cystéine non appariée dans le dimère (figure 4B). À cette fin, deux mutants ont été conçus: l'un a supprimé le problème de la cystéine, entraînant une baisse soudaine du rendement (figure 4A); Après l'introduction de la néocystéine pour reconstruire la liaison disulfure conforme, le mutant avait non seulement un rendement élevé et une bonne stabilité, mais pourrait également cristalliser (figure 4C), et la structure 3D a confirmé que le mutant formait la bonne liaison disulfure et maintenait le repliement naturel. Ce cas démontre qu'en concevant rationnellement les liaisons disulfure conformes, combinées à une filtration du gel et à l'analyse de la spectrométrie de masse, le problème de repliement des protéines recombinantes peut être résolu efficacement et des protéines fonctionnelles avec des structures stables et des rendements élevés peuvent être obtenus.

Figure 4. La reconstruction de la liaison disulfure améliore le pliage et le rendement de LLT1 soluble

 

 

 

10. Protéines facilement agrégables

La purification des protéines recombinantes est souvent confrontée au problème de l'agrégation, et sa formation suit le mécanisme de la "naucléation-croissance" - une petite quantité d'agrégats solubles se forme d'abord puis déclenche une agrégation insoluble à grande échelle. Pour relever ce défi, des stratégies à plusieurs niveaux doivent être adoptées: au stade d'expression, cela peut être réalisé en optimisant la souche, en réduisant la température de culture, en utilisant des milieux de culture modifiés ou des protéines de fusion solubilisantes différentes et en remplacement des systèmes d'expression (insectes \/ cellules de mammifères), etc. Pendant le stade de purification, une opération rapide (dans un environnement à 4 degrés) est nécessaire pour éviter la concentration de protéines excessives, et une «purfication rapide» (tel que la connexion directe de l'immeuble de protéines est excessive, et une stratégie rapide (tel que de la connexion directe de l'iMPA à sec) doit être adopté pour éliminer rapidement les noyaux agrégés. D'une manière générale, lors des solutions de tampon de dépistage, des facteurs tels que la composition des composants, la valeur du pH, l'agent dissociant ou le solubilisation doivent être pris en considération (figure 5). Grâce à l'optimisation fine de la détection orthogonale (telle que SEC, CD, LS, DSF et le décalage de température en fonction de la chaleur de fluorescence, etc.), la qualité des protéines et la solution tampon la plus appropriée ont été déterminées.

Figure 5. Stratégies pour atténuer l'agrégation des protéines

 

11. Crystallisation de la kinase humaine Clk1 (comment obtenir des lots reproductibles)

Pour obtenir une kinase homogène non phosphorylée de Clk1 pour les études de cristallisation, un schéma collaboratif multi-stratégie a été adopté. Premièrement, il a été co-exprimé avec la λ -phosphatase dans Escherichia coli pour éliminer l'hétérogénéité de l'autophosphorylation. Bien que le rendement ait été réduit, une déphosphorylation complète a été assurée. Après capture par IMAC, l'éluant a été complété avec des stabilisateurs (arginine 50 mm, acide glutamique 50 mm et DTT 10 mm) pour empêcher l'agrégation, concentrée, et la balise His a été retirée par digestion TEV. Ensuite, l'oligomère correct a été séparé par SEC (contenant 5% de glycérol et -Me). La dernière étape d'échange crucial d'anions distingue les groupes CLK1 cristallins (non phosphorylés) et non cristallins (partiellement phosphorylés). Il convient de noter particulièrement que le mode de lyse cellulaire affecte considérablement la stabilité des protéines - la méthode à haute pression et à haute température conduit à une agrégation irréversible de Clk1, mettant en évidence l'importance d'un traitement léger pour la préparation de la kinase.

 

 

 

12. Produire de la galectine -1 avec une capacité de liaison au ligand stable

Pour préparer la galectine fonctionnelle -1 pour les études de liaison au ligand, les stratégies d'expression et de purification de quatre constructions (galectine de type sauvage sans étiquette et non marquée et sa galectine mutante sans truquage à la cystéine sans cystéine {6}) étaient comparées. Les principaux résultats indiquent que la purification de la chromatographie sur l'affinité du lactose peut effectivement dépister les protéines correctement pliées, mais elle doit être combinée avec une dialyse approfondie (tampon HEPES) pour éliminer complètement le lactose du site de liaison et restaurer l'activité CRD. La galectine de type sauvage -1 est sujette à l'oxydation et à l'inactivation, et sa stabilité reste limitée même en présence d'agents réducteurs (figure 6). Cependant, le mutant sans cystéine améliore considérablement la stabilité à long terme tout en maintenant une activité d'agglutination comparable et une stabilité thermique (vérifiée par NanoDSF, ITC, etc.) en éliminant la dépendance aux liaisons disulfure.

Figure 6. La caractérisation hydrodynamique de la galectine recombinante -1 révèle son instabilité

 

13. Élimination des endotoxines

La méthode d'élimination des endotoxines est basée sur une chromatographie d'affinité, notamment la chromatographie chargée positivement (échange d'anions), l'utilisation de ligands polycochéiques (tels que la poly-l-lysine (PLL), la polyamine immobilisée (polymyxine B)) et l'ajout du surfactant Triton x -114. Pendant le processus de purification, faites attention à la préparation de la solution tampon avec de l'eau sans LPS et utilisez de nouvelles colonnes ou colonnes qui n'ont été utilisées que dans d'autres purifications sans LPS. Pour la contamination de l'endotoxine, le système de pompe \/ fluide chromatographique peut être incubé pendant la nuit dans 0. 5m NaOH ou pendant 4 heures en 1. 0 m NaOH. La quantité finale de LPS dans l'échantillon a été évaluée à l'aide d'un réactif de lysat d'amébocytes limulus (LAL), et il a été vérifié s'il était inférieur à la limite requise pour l'application spécifique.

 

14. Complexe protéique

L'expression et la purification des complexes protéiques doivent être optimisées en fonction de conditions spécifiques. Les défis incluent l'instabilité ou le mauvais repliement des sous-unités. Chaque sous-unité peut être exprimée indépendamment et assemblée in vitro ou co-exprimée pour former des complexes de protéines fonctionnelles. La conception de la construction doit être soigneusement introduite avec des étiquettes de purification ou de détection pour éviter d'interférer avec l'assemblage, en particulier lorsque les informations complexes sont limitées et que de multiples optimisations sont nécessaires. Pendant le processus de purification, l'intégrité et la stabilité du complexe doivent être évaluées. Les méthodes comprennent le SDS-PAGE (détection des sous-unités), SEC (homogénéité), SEC-Mals (analyse de masse molaire), la photométrie de masse ou la spectrométrie de masse naturelle (vérification de masse). Il convient de noter que le complexe peut se dissocier à de faibles concentrations. À l'heure actuelle, la méthode chromatographique ou le tampon (comme par la dérive thermique ou les conditions de dépistage du DSF) doit être optimisée. De plus, la réduction des étapes de purification peut empêcher la perte de sous-unités d'interaction faibles et équilibrer l'efficacité de purification et l'intégrité du complexe.

 

 

 

15. Purification des complexes antigènes-anticorps

Les complexes anticorps-antigènes sont des exemples typiques de complexes protéiques. Leur co-cristallisation peut révéler des modèles de liaison et guider l'optimisation de l'ingénierie des anticorps. Les méthodes traditionnelles nécessitent une purification distincte des antigènes et des anticorps, puis les mélangeant. Cependant, des études récentes ont montré que les stratégies de co-expression et de co-purification sont plus efficaces. Une seule purification est nécessaire pour obtenir le complexe, et en même temps, les antigènes instables peuvent être stabilisés par des anticorps, et même une expression sans étiquette peut être obtenue. Dans cette situation spécifique, la filtration SDS-PAGE et le gel (SEC) est généralement suffisante pour évaluer la pureté et la qualité du complexe.

 

Résumé

La purification des protéines est une technologie fondamentale dans la recherche scientifique. La production de protéines à l'échelle académique suit généralement des stratégies standard et peut produire des protéines solubles de haute pureté de haute pureté en milligrammes, qui sont largement utilisées en biologie structurelle, biochimie et recherche fonctionnelle. Cependant, les exigences particulières des applications en aval (telles que la nécessité de aucune endotoxine dans les expériences animales et aucune contamination nucléase dans la recherche sur l'acide nucléique) ou les caractéristiques inhérentes des protéines (telles qu'une agrégation facile, contenant des liaisons disulfure ou une affinité élevée d'acide nucléique) nécessitent souvent des solutions personnalisées. Cette revue, en réponse à ces circonstances particulières, propose des stratégies raffinées allant de la sélection des systèmes d'expression, de la conception de constructions (optimisation des étiquettes et des limites de domaine) au processus de purification et introduit un contrôle de qualité (tel que SEC, SDS-PAGE, détection d'activité, etc.) à des étapes clés. Certaines applications nécessitent également une analyse supplémentaire (telle que la détection des endotoxines et la détermination des résidus d'acide nucléique), similaire au concept "d'assurance qualité" (QA) dans l'industrie biopharmaceutique, c'est-à-dire pour éviter les défauts par des processus systématiques. En formulant les directives de contrôle de la qualité et en clarifiant des normes spécifiques pour les réactifs protéiques utilisés dans la recherche scientifique, l'objectif est d'établir des normes de purification des protéines plus rigoureuses pour les laboratoires académiques, d'améliorer la fiabilité et la répétabilité des données expérimentales et combler l'écart entre la recherche fondamentale et les normes industrielles.

 

Doi: 10.1186 \/ s 12934-022-01778-5