Brève discussion de plusieurs méthodes uniques de purification des fibres creuses par inclusion

Les corps d'inclusion (IB) sont des particules protéiques insolubles de haute densité enveloppées dans des membranes formées lorsque des gènes étrangers sont exprimés dans des cellules procaryotes, en particulier chez Escherichia coli. Lorsqu'elle est observée au microscope, l'IB est une région à haute réfraction, évidemment différente des autres composants du cytoplasme.

La formation des corps d'inclusion est relativement complexe, liée au taux de production de protéines dans le cytoplasme, à la concentration de peptides nouvellement générés et au manque de temps pour se replier afin de former des agrégats de protéines amorphes. Les corps d'inclusion sont essentiellement composés de protéines, dont plus de 50 % sont des produits clonés. La structure primaire de ces produits est tout à fait correcte, mais la configuration tridimensionnelle est erronée, il n’y a donc aucune activité biologique. La taille du corps de l'inclusion est de 0,5-1μm, insoluble dans l'eau, uniquement soluble dans les dénaturants tels que l'urée, le chlorhydrate de guanidine, etc.

Dans E. coli, les corps d'inclusion peuvent apparaître à deux endroits de la cellule : le cytoplasme et le cytoplasme périphérique. L'emplacement et les caractéristiques des corps d'inclusion dans la cellule dépendent de la manière dont les protéines sont exprimées.

Les inclusions dans le cytoplasme d'E. coli ont généralement un diamètre compris entre {{0}},2 à 1,5 μm, et différentes protéines ont des diamètres différents, par exemple la taille de l'interféron est de 0,811 μm et la taille de la prorène est de 1,281 μm. Dans certains cas, le diamètre de certains corps d'inclusion est supérieur au diamètre d'E. coli, ce qui donne à E. coli une saillie. En général, une cellule ne possède qu’un seul corps d’inclusion.

 

Purification du corps d'inclusion

 

Le processus de purification des corps d’inclusion est généralement :

Broyage cellulaire :

La technologie générale de concassage cellulaire est la suivante : concassage de tissus à grande vitesse, homogénéisation par homogénéisateur de verre, traitement par ultrasons, méthode de gel-dégel répétée, traitement chimique (généralement utilisant un traitement au lysozyme).

 

Inclusion du lavage du corps :

Les corps d'inclusion sont des particules solides inactives formées par agglutination intracellulaire de protéines exprimées par des bactéries, qui existent généralement sous forme amorphe et insoluble. Dans le corps d'inclusion, la véritable protéine cible ne représente qu'environ 50 % et le reste contient des lipides, des lipopolysaccharides, des acides nucléiques et des hétéroprotéines, qui sont liés au corps d'inclusion et affectent la renaturation de la protéine du corps d'inclusion. Le lavage avant dénaturation est donc une étape très nécessaire.

De plus, le lavage des corps d’inclusion est utile pour augmenter le rendement de repliement des protéines recombinantes. En éliminant les impuretés, les obstacles dans le processus de renaturation peuvent être réduits, de sorte que la protéine puisse être pliée et assemblée correctement plus efficacement, améliorant ainsi l'activité et la fonction de la protéine‌.

Le lavage utilise couramment moins de 1 % de détergent neutre, tel que Tween, Triton, Urée et NP40 plus EDTA et agents réducteurs 2-mercaptotréitol (DTT), -mercaptoéthanol répété plusieurs fois, car la capacité de lavage du détergent est améliorée avec l'augmentation de la force ionique de la solution, lors du lavage des corps d'inclusion peut être ajouté du NaCl pour augmenter la force ionique.

Les corps d'inclusion peuvent être utilisés pour éliminer d'autres composants de la solution de dégradation cellulaire par centrifugation ou filtration, toutes deux tirant parti des différentes propriétés physiques des corps d'inclusion.

 

Centrifugation :

Les protéines du corps d’inclusion sont beaucoup plus denses que le même volume de fragments cellulaires, de sorte que le corps d’inclusion peut être séparé du reste de la cellule par centrifugation. La centrifugation continue est l'opération la plus fréquemment utilisée pour obtenir des corps d'inclusion dans la production industrielle. La densité des fragments cellulaires étant inférieure à celle du corps d’inclusion, la vitesse de sédimentation est inférieure à celle du corps d’inclusion. La suspension continue et la centrifugation peuvent centrifuger la majeure partie du corps d'inclusion, tandis que les fragments cellulaires sont progressivement éliminés.
Filtration (filtration à flux tangentiel) : En raison des différentes tailles moléculaires des corps d'inclusion et des protéines solubles, la méthode de filtration peut être utilisée, ce qui peut réduire les coûts d'exploitation et faciliter la mise à l'échelle. La filtration à flux tangentiel (TFF) est pilotée par la différence de pression transmembranaire. Les substances et impuretés plus petites que la taille des pores de la membrane traversent la membrane, tandis que les impuretés telles que les cellules contenant des particules plus grosses sont piégées. L'ouverture de la membrane généralement utilisée pour le lavage par filtration est de 0,1 μm. La microfiltration à flux tangentiel à fibres creuses peut traiter directement une teneur élevée en solides de matériau liquide, moins d'étapes, une opération simple, la membrane peut être utilisée à plusieurs reprises par le biais du nettoyage, réduisant ainsi l'investissement en équipement et les coûts d'exploitation, conformément aux exigences de la production automatisée modulaire.

 

Ce qui suit est un cas d'application pour le lavage de corps d'inclusion à l'aide de colonnes à fibres creuses Guidling.

Nous avons utilisé des fibres creuses de 94 cm2 0.1-0,45 μm pour concentrer 250 mL de liquide (poids moléculaire de la protéine cible : 17 kd). Dans l’ensemble du processus de lavage, le taux de récupération de la protéine cible et l’épuisement du flux membranaire ont été étudiés.

0-71min est le processus de concentration, 71-224min est le processus de lavage et de filtration. Pendant tout le processus de microfiltration, le TMP a progressivement augmenté, la vitesse d'entrée du liquide est restée inchangée et le flux de matière moyen était de 12 LMH.

Les résultats ont montré que la protéine cible était complètement piégée et que le taux de récupération de la protéine cible était supérieur à 90 %. Les colonnes de guidage à fibres creuses sont stables et adaptées à cette application.

 

Dissolution du corps d’inclusion :

Les corps d'inclusion sont généralement dissous dans les conditions d'un agent dénaturant, l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, et les protéines du corps d'inclusion dissoutes sont complètement dénaturées, c'est-à-dire que, sauf que la structure primaire et les liaisons covalentes sont conservées, toutes les liaisons hydrogène et hydrophobes sont détruites et hydrophobes. les chaînes latérales sont complètement exposées.

L'urée et le chlorhydrate de guanidine sont des dénaturants de force moyenne, qui sont facilement éliminés par dialyse et ultrafiltration. La concentration générale d'urée 8-10M, de chlorhydrate de guanidine 6-8M. La dissolution de l'urée présente les avantages de la non-ionisation, de la neutralité, du faible coût, l'élimination des protéines après la renaturation ne provoquera pas une grande quantité de précipitation de protéines, et les corps d'inclusion dissous peuvent être purifiés par diverses méthodes chromatographiques, ils ont donc été largement utilisés. .

 

Repliement des protéines du corps d'inclusion :

La protéine recombinante dissoute doit être repliée correctement pour former une protéine fonctionnelle. Les techniques de renaturation comprennent la dilution de la solution protéique jusqu'à un état presque neutre, l'élimination du dénaturant, la renaturation sur colonne et la chromatographie par filtration sur gel. Parmi eux, la dilution de la solution protéique à un niveau presque neutre et l'élimination du dénaturant sont une méthode classique courante de renaturation, en particulier la méthode de renaturation par dilution qui a le taux d'utilisation le plus élevé.

Élimination des dénaturants :

Dialyse : L'avantage est que le volume n'augmente pas et que le taux d'élimination du dénaturant est contrôlé en réduisant progressivement la concentration du liquide perméable externe, mais cela prend beaucoup de temps et il est facile de former des agrégats de protéines inactifs, ce qui ne convient pas pour opération à grande échelle et ne peut pas être appliqué à l’échelle de production.

Ultrafiltration (TFF) : facile à contrôler la vitesse de dialyse, que ce soit en recherche et développement, en test pilote ou en production, permet d'éliminer les dénaturants (changement de liquide + concentration) par ultrafiltration (TFF).

 

Purification des protéines corporelles d'inclusion :

Les méthodes de purification des protéines après renaturation sont similaires à celles de la purification des protéines solubles, à savoir la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie par filtration sur gel, la chromatographie d'affinité, la précipitation par relargage de sulfate d'ammonium, etc.

Les corps d'inclusion n'ont aucune activité biologique, il n'y a pas lieu de s'inquiéter de la perte d'activité protéique et de grandes quantités d'expression n'entraîneront pas la mort cellulaire et maximiseront la résistance aux attaques de protéases. La fibre creuse Jiuling peut être appliquée de manière flexible dans le processus de purification en aval des corps d'inclusion. Dans l'étape de lavage du corps d'inclusion, d'excellentes performances, par rapport au lavage centrifuge, l'utilisation de fibres creuses de microfiltration à technologie neuf pour le lavage par filtration à flux tangentiel peut considérablement raccourcir le temps de processus et le taux de récupération général peut atteindre plus de 90 %. La fibre creuse Jiuling peut également être utilisée dans l’étape de renaturation des protéines des corps d’inclusion. La turbidité du liquide d'alimentation filtré par fibre creuse de microfiltration sera considérablement réduite et le taux de récupération des protéines est élevé ; L'utilisation de fibres creuses d'ultrafiltration peut non seulement éliminer les dénaturants, mais également raccourcir le temps de chargement de l'échantillon chromatographique, afin de gagner du temps, de réduire le volume de charge et de réduire les coûts de production. Le taux de récupération des fibres creuses de microfiltration/ultrafiltration varie selon les différents matériaux, et le taux de récupération général peut atteindre 90-95 %.

Guidling Technology vous invite à demander des kits de test pour les examens associés.

 

À propos du guidisme

Guidling Technology est une entreprise nationale de haute technologie axée sur les produits biopharmaceutiques, la culture cellulaire, la purification et la concentration de fluides biomédicaux, de diagnostic et industriels. Nous avons développé avec succès des dispositifs de filtration centrifuge, des cassettes d'ultrafiltration et de microfiltration, un filtre anti-virus, un système TFF, un filtre en profondeur, des fibres creuses, etc. qui répondent pleinement aux scénarios d'application des produits biopharmaceutiques, de la culture cellulaire, etc. Nos membranes et filtres membranaires sont largement utilisés en concentration, extraction et séparation de préfiltration, microfiltration, ultrafiltration et nanofiltration. Nos nombreuses gammes de produits, depuis les petites filtrations de laboratoire à usage unique jusqu'aux systèmes de filtration de production, en passant par les tests de stérilité, la fermentation, la culture cellulaire et bien plus encore, répondent aux besoins des tests et de la production. Guidling Technology est impatient de coopérer avec vous !