Vaccin aux particules de type virus et son processus de purification en aval

Le vaccin des particules de type virus (VLP) est une technologie de vaccin qui est basée sur la structure du virus mais ne contient pas les matériaux génétiques viraux. Ils stimulent une forte réponse immunitaire en imitant la morphologie et les antigènes de surface des virus naturels, et offrent une plus grande sécurité en raison de leur incapacité à se répliquer. Les vaccins VLP sont une meilleure alternative aux vaccins traditionnels (en direct atténué et inactivé). Le vaccin VLP ne peut pas se reproduire dans le corps, il convient donc à tout le monde, y compris les femmes enceintes ou celles dont le système immunitaire est compromis. De plus, les protéines de capside (y compris d'autres protéines structurelles) à partir de virus avec des génomes segmentés, tels que les virus de la grippe, les virus africains de la maladie des chevaux et les virus de Bluetongue, peuvent également être utilisés pour développer des vaccins VLP sans se soucier des problèmes de recombinaison génétique tels que des vaccins vivants atténués. Deuxièmement, les VLP sont capables d'imiter la structure des virus réels, contrairement aux vaccins inactivés, dont les protéines structurelles peuvent être modifiées pendant l'inactivation, entraînant une déficience immunogène.

 

FIGUE. 1. Mécanisme de formation des VLP et des VLP chimériques

 

Caractéristiques du vaccin VLP

1. Structure similaire aux virus naturels: les VLP sont auto-assemblés par une ou plusieurs protéines structurelles virales (comme les protéines de capside), et leur taille et leur forme sont similaires aux virus réels.

2. Non-infectieux: ne contient pas le génome viral, ne peut pas reproduire ou provoquer une maladie.

3. Immunogénicité élevée: la structure granulaire peut être reconnue efficacement par le système immunitaire et activer les réponses des cellules B et des cellules T. Peut induire des anticorps neutralisants et l'immunité cellulaire (par exemple, VIH, vaccins contre le VPH).

4. Sécurité élevée: adapté aux personnes ayant une faible fonction immunitaire (comme le vaccin VLP de l'hépatite B).

 

FIGUE. 2. Vaccines VLP disponibles

 

Système de production de vaccins VLP

Les VLP peuvent être produits via une variété de systèmes d'expression, les plates-formes communes comprennent:

 

1. Système d'insectes cellule-baculovirus:

Avantages: rendement élevé, faible coût, adapté à l'assemblage des protéines complexes.

Application: Vaccin HPV, vaccin Ebola.

 

2. Cellules de mammifères (par exemple les cellules HEK293):

Avantages: Les modifications post-traductionnelles sont plus proches des humains et adaptées aux VLP enveloppées (comme les vaccins contre la grippe).

 

3. Systèmes de levure (par exemple, Pichia pastoris):

Avantages: Rapide et faible coût, a été utilisé dans le vaccin contre l'hépatite B.

 

4. Systèmes végétaux (par exemple, chloroplastes de tabac):

Environnement et évolutif, en cours de développement (par exemple, vaccin contre le Norovirus VLP).

 

Processus de purification en aval du vaccin VLP

La diversité des systèmes d'expression de VLPS conduit à l'inuniversalité des processus de purification en aval.

 

 

FIGUE. 3 Un graphique de flux de processus en aval général

 

Récolte et clarification:

Dans toutes sortes de milieu de culture, propulsant par la culture cellulaire, il existe un grand nombre de particules virales, ainsi que de nombreux débris tissulaires cellulaires, produits métaboliques et autres impuretés, ce qui rend le milieu de culture nuageux ou semi-nuage, si la concentration du milieu de culture est directement terminée et que la membrane ultrafiltration sera bloquée, le résultat de la concentration ne peut pas être terminé et que la membrane ultrafiltration sera bloquée. Par conséquent, il doit être clarifié d'abord avant la concentration, pour éliminer les grandes particules dans le milieu de culture, afin qu'il devienne une solution translucide ou transparente, et la concentration du milieu de culture peut rendre le processus de concentration normal et assurer la durée de vie de la membrane d'ultrafiltration. La clarification avant la concentration de la solution de culture est un lien technique clé dans le processus de concentration.

 

Un processus de clarification efficace nécessite une combinaison de haute capacité pour éliminer les particules solides, un rendement élevé du produit, une échelle facile et une protection des unités de fonctionnement en aval.

 

Méthode

Centrifugation: la centrifugation différentielle élimine les grandes particules.

Filtration profonde: utilisez un filtre à plusieurs étages (par exemple 1,2 μm → 0. 45μm) pour clarifier le surnageant.

Filtration d'écoulement tangentiel (TFF): Convient à la production de masse, concentre les échantillons et élimine de petites particules d'impuretés.

 

Cependant, si l'échelle de culture est trop grande, la centrifugation prend beaucoup de temps, un grand nombre de membranes filtrantes profondes seront nécessaires, donc le coût des consommables augmente considérablement. Dans le même temps, la forte densité de la culture cellulaire réduira la charge de la membrane filtrante profonde, entraînant une augmentation des coûts et une dilution excessive des produits.

 

Il existe deux types de composants de membrane TFF: une cassette plate et une fibre creuse. La filtration d'écoulement tangentielle (TFF) est entraînée par la différence de pression transmembranaire. Les substances et les impuretés qui sont plus petites que les pores membranaires passent à travers la membrane, tandis que les impuretés telles que les cellules avec des particules plus grandes sont piégées. La taille des pores de la membrane utilisée pour la microfiltration est {{0}}. 45 / 0,22 μm. Les fibres creuses peuvent traiter directement du liquide à haute teneur en solide, telles que le milieu de culture cellulaire à haute densité, il peut éliminer les étapes de centrifugation et de pré-filtration, moins d'étapes, un fonctionnement simple, la membrane peut être utilisée à plusieurs reprises en nettoyant, réduisant l'investissement des équipements et les coûts d'exploitation, conformément aux exigences de la production automatisée modulaire.

 

Concentration d'ultrafiltration (TFF):

Cible: Pour réduire la quantité de traitement chromatographique, améliorez l'efficacité chromatographique et protégez la colonne chromatographique.

En général, l'ultrafiltration (TFF) peut se concentrer plus de 100 fois de VLP, et le taux d'élimination de l'hétéroprotéine peut atteindre 99%. Parmi eux, la technologie de filtration de la membrane à fibres creuses présente les avantages d'une force de cisaillement légère et faible, pas facile à brancher, un fonctionnement flexible, une longue durée de vie, un faible coût et une amplification facile, il est donc recommandé de choisir des fibres creuses pour un VLP concentré et purifié.

 

Lorsque une méthode d'ultrafiltration est utilisée pour la concentration et la purification, il est très important de sélectionner la bonne taille des pores membranaires, ce qui détermine directement l'efficacité et la qualité de la concentration. D'une part, il est nécessaire de sélectionner l'ouverture de la membrane pour piéger efficacement les molécules cibles pour garantir le rendement, et d'autre part, l'effet d'élimination et la vitesse de traitement des hétéroprotéines doivent être pleinement pris en compte. Par conséquent, le meilleur principe consiste à sélectionner la membrane avec la plus grande taille de pores qui peut piéger la molécule cible et essayer de sélectionner la membrane filtrante avec une distribution uniforme de la taille des pores.

 

Purification primaire:

1. Méthode des précipitations

Précipitation en polyéthylène glycol (PEG): la précipitation sélective des VLP nécessite une concentration optimisée de PEG et une concentration de sel pour équilibrer le rendement et la pureté.

 

2. Chromatographie

Chromatographie d'affinité:

Affinité de l'héparine: en utilisant les propriétés VLPS de la charge négative de surface (par exemple, VLP HPV).

Chromatographie de couplage des anticorps: haute spécificité mais coûteuse.

Chromatographie d'échange d'ions (IEX): choisissez l'échange d'anions (par exemple, colonne Q) ou l'échange de cations (par exemple, colonne SP) en fonction des caractéristiques de charge de surface VLP et optimiser le pH et le gradient de sel pour éviter l'agrégation des particules.

Chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC): basée sur l'hydrophobicité de surface VLPS, adaptée à certains VLP non encapsulés.

 

Purification fine:

Chromatographie d'exclusion moléculaire (SEC, filtration sur gel):

Élimination des protéines hôtes résiduelles, des acides nucléiques ou des agrégats, accompagnés d'un remplacement du tampon. Flux haute résolution mais faible, souvent utilisé comme étape de raffinement finale.

 

Chromatographie multimode:

Par exemple, les résines de la série Capto Core, combinées à l'échange d'ions et à l'effet de tamis moléculaire, peuvent éliminer une variété d'impuretés en une seule étape.

 

Inactivation du virus / élimination de l'acide nucléique (si nécessaire):

Traitements de nucléases: comme la benzonase dégrader l'ADN / ARN hôte.

UF / DF: coordination du système TFF pour éliminer les petits fragments d'acides nucléiques et d'enzymes.

 

Concentration et préparation:

Filtration de débit tangentiel (TFF):

Concentrez-vous pour cibler les titres tout en déplaçant les tampons (tels que le PBS ou les tampons de formulation).

 

Filtration stérile:

0. La filtration de la membrane de 22 μm assure la stérilité.

 

Cas typique

Voici les processus de purification en aval pour les vaccins VLP typiques.

 

 

À propos de Guiding

La technologie de guidage est une entreprise axée sur la production et de haute technologie axée sur la clarification, la séparation et la purification en aval des biopharmaceutiques. Les produits sont largement utilisés dans le processus de filtration du mAb, du vaccin, du diagnostic, des produits sanguins, du sérum, de l'endotoxine et d'autres produits biologiques; La technologie de guidage a "Cassettes Filtre et Dispositif de filtration de flux tangentiel", "Membrane à fibre creuse", "filtre virus", "membrane profonde", "filtre de stérilisation", "dispositifs de filtre centrifuge" et autres produits, et possède un grand nombre de gammes de produits, à partir de petits dispositifs de filtration de laboratoire disposables pour la filtration de production, répond aux besoins des tests et de la production. La technologie de guidage est impatient de coopérer avec vous!