Application de l'ultrafiltration à la production de vaccin contre la rage humaine
Afin de promouvoir l'application de l'ultrafiltration dans la production de vaccin antirabique humain, une cassette membranaire d'ultrafiltration de 300 kDa a été utilisée pour concentrer la solution de récolte du virus de la rage et détecter la récupération de l'antigène, le taux d'élimination des endotoxines et le taux d'élimination des protéines de l'hôte après ultrafiltration. Les résultats ont montré que sous la pression appropriée, la solution de récolte du virus de la rage était concentrée 80 fois, éluée 25 fois, le taux de récupération de l'antigène était de 86,2 %, le taux d'élimination des endotoxines bactériennes était de 87,5 % à 88,7 % et le taux d'élimination des protéines de l'hôte était de 91,6 %.
Avant-propos
La rage est une maladie zoonotique ancienne et traditionnelle causée par le virus de la rage (RV), avec un taux de mortalité pouvant atteindre 100 %. À l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement efficace contre la post-exposition (c'est-à-dire les lésions de la peau et des muqueuses) autre que le vaccin d'urgence et la vaccination par immunoglobulines. La principale source de rage chez l'homme sont les morsures d'animaux malades ou potentiellement infectés (principalement des chiens). Le taux de mortalité dû à la rage en Chine se classe au deuxième rang mondial et la rage est l'un des problèmes qui menacent la sécurité de la santé publique dans notre pays. La glycoprotéine capsulaire du virus de la rage, qui est le seul antigène clé qui induit la production d'anticorps neutralisants protecteurs, a fait l'objet de recherche et de développement de nouveaux vaccins et de nouvelles technologies de diagnostic et de traitement du virus de la rage.
Le virus de la rage appartient au genre virus de la rage de la famille des rhabdovirus. La forme de la nucléocapside est élastique, la nucléocapside est à symétrie hélicoïdale et la surface présente une enveloppe contenant de l'ARN simple brin. C'est l'agent pathogène qui cause la rage. Le virus de la rage possède deux antigènes principaux : l'un est l'antigène glycoprotéique présent sur la membrane externe du virus, qui peut se lier au récepteur de l'acétylcholine pour rendre le virus neurotoxique et produire des anticorps neutralisants et des anticorps inhibiteurs de l'hémagglutination dans le corps, et les anticorps neutralisants ont un effet protecteur ; L'autre est l'antigène riboprotéique interne, qui peut amener le corps à produire des anticorps de liaison au complément et de la précipitine, et n'a aucun effet protecteur.
L'endotoxine est une sorte de substance lipopolysaccharide (LPS), qui présente une résistance à la chaleur et une stabilité chimique et n'est pas facile à détruire. S'il y a une certaine concentration d'endotoxine dans le vaccin, cela provoquera une fièvre sévère et même la mort après la vaccination, la teneur en endotoxine dans le vaccin doit donc être réduite autant que possible. L'édition 2005 de la Pharmacopée chinoise (Partie III) a déterminé que la valeur de contrôle de l'indice qualifié d'endotoxine du vaccin antirabique ne doit pas être supérieure à 100 UE/dose. Avec le développement rapide de la technologie de séparation par membrane, l’application de la technologie de séparation par membrane par ultrafiltration pour réduire la teneur en endotoxine des vaccins est de plus en plus répandue dans l’industrie pharmaceutique.
Un vaccin contre la rage est un vaccin contre la rage. Il existe généralement trois types de vaccins contre la rage, notamment le vaccin sur cellules Vero purifiées, le vaccin sur cellules diploïdes humaines et le vaccin sur culture cellulaire primaire. Le vaccin contre la rage est fabriqué en inoculant le virus fixé du virus de la rage dans une matrice cellulaire, après culture, récolte, concentration, inactivation, purification et ajout d'un stabilisant approprié. La fonction principale du vaccin antirabique est de stimuler l'organisme à produire une réponse immunitaire rapide et à produire des anticorps protecteurs contre le virus de la rage, afin de prévenir l'infection causée par le virus et de réduire le risque de maladie.
Le processus de production du vaccin joue un rôle important pour garantir la qualité du vaccin, en particulier la quantification de certains indicateurs dans le processus de production est plus importante. Dans le processus de production du vaccin antirabique humain, la technologie de concentration par ultrafiltration est un moyen nécessaire pour produire un vaccin antirabique humain. L'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration à ouverture raisonnable pour la concentration d'ultrafiltration peut éliminer efficacement les endotoxines et les protéines de l'hôte et conserver l'antigène RV, ce qui est propice à la production de vaccins et à l'amélioration de la qualité. La masse moléculaire relative des molécules RV est de 350 kDa à 460 kDa et, en théorie, le RV peut être complètement piégé par concentration par ultrafiltration à l'aide d'une cassette membranaire avec un poids moléculaire d'interception de 100 kDa et 300 kDa. L'endotoxine forme souvent une structure globale dans différentes solutions aqueuses, en raison du degré d'agrégation, la taille moléculaire est différente. La masse moléculaire relative du monomère d'endotoxine est de 10 kDa à 20 kDa, et la masse moléculaire relative de sa forme de polymérisation est de 300 kDa à 1 000 kDa ou supérieure à 1 000 kDa. Sur la base de la différence de poids moléculaire, l'antigène RV dans le vaccin antirabique humain a été retenu et l'endotoxine et la protéine hôte du vaccin antirabique humain ont été éliminées par une membrane d'ultrafiltration de 300 kDa.
Dans cette expérience, une cassette à membrane d'ultrafiltration avec une ouverture de 300 kDa et une surface de membrane de 0,11 m2 a été utilisée comme traitement de petits échantillons pour concentrer les produits intermédiaires du vaccin antirabique humain, ainsi que le flux membranaire, l'efficacité du traitement, la concentration multiple, l'interception de l'antigène et l'élimination des endotoxines. , et l'élimination des protéines de l'hôte ont été testées.
2Méthode matérielle
2.1 Matériel expérimental
Le virus de la rage a fixé la souche CTN-IV du virus ; Cellules Véro ; 0,5 M d'hydroxyde de sodium ; Cassette à membrane d'ultrafiltration 300kDa (matériau PES, surface de membrane de 0,11 m²).
2.2 Méthodes expérimentales
2.2.1 Préparation de la solution de récolte de virus
Les cellules Vero congelées ont été réanimées dans de l'eau tiède à 37 degrés ~ 39 degrés, la suspension cellulaire a été sirotée, puis ajoutée à un milieu de culture 199 contenant 1 0 % de sérum de veau inactivé. Des cellules monocouches uniformes ont été cultivées à 37 degrés. La souche CTN-IV a été inoculée avec le virus de la rage à un rapport de 0,1 mol/L et cultivée à 37 degrés. Après 48 heures, le milieu de culture a été jeté et un milieu de culture 199 contenant 0,1 % d'albumine sanguine humaine a été ajouté pour maintenir la culture à 33 degrés ~ 35 degrés. Récoltez le venin de la maladie une fois tous les 3 jours -5 jours et combinez les multiples fluides de récolte.
2.2.2 Installation de la cassette à membrane
Installez la cassette à membrane et connectez le câblage comme indiqué dans la figure ci-dessous.
2.2.3 Lavage à l'eau
Fermez la vanne d'entrée, le robinet de retour et le robinet de passage, puis insérez l'extrémité de retour et le tuyau d'extrémité traversant dans le réservoir de liquide usé. Remplissez le réservoir d'admission avec 1 L d'eau pour injection.
Ouvrez les vannes d'entrée et de retour, fermez les vannes de passage, ouvrez la pompe, nettoyez la conduite de retour avec 10 % du volume d'eau purifiée ou d'eau pour injection et maintenez la pression d'entrée à 0,35 bar (5 psi).
Ouvrez la vanne du filtre, fermez le clapet de retour et utilisez l'eau d'injection restante pour nettoyer le tuyau du filtre, en maintenant le TMP à 0,35 bar.
2.2.4 Désinfection
Fermez la soupape d'admission, la soupape de retour et la soupape de transmission, et insérez les conduites d'extrémité de retour et d'extrémité de transmission dans le réservoir de liquide usé. Remplissez le réservoir d'admission avec 2 L de solution de nettoyage.
Ouvrez les vannes d'entrée et de retour, fermez les vannes de passage, ouvrez la pompe, nettoyez la conduite de retour avec 200 mL d'hydroxyde de sodium 0,5 M et maintenez la pression d'entrée à 0,35 bar (5 psi). .
Ouvrez le robinet de passage, fermez le robinet de retour et nettoyez le tuyau de passage avec un volume de 200 mL de solution de nettoyage, en maintenant le TMP à 0,35 bar.
Ensuite, l'extrémité de retour et le tuyau d'extrémité traversante sont insérés dans le réservoir de liquide pour un nettoyage cyclique. Cycle de nettoyage avec 1 à 1,5 fois le débit tangentiel du processus pendant 30 minutes.
Égoutter 0,5 M d'hydroxyde de sodium et rincer à l'eau pour préparations injectables selon 2.2.4 jusqu'à neutralité.
2.2.5 Test de flux d'eau
Ajoutez de l'eau purifiée dans le réservoir d'admission, mesurez et enregistrez la température de l'eau dans le réservoir d'admission. Insérez l'extrémité de retour dans le réservoir. Démarrez la pompe et ajustez la vitesse de la pompe et le clapet de retour pour obtenir une différence de pression transmembranaire de 0,35 bar (5 psi). À l’aide d’un cylindre, mesurez et enregistrez le débit à l’extrémité traversante en ml/min. Ajustez la vitesse de la pompe et le clapet de retour pour obtenir une pression différentielle transmembranaire de 1 bar (15 psi). À l’aide d’un cylindre, mesurez et enregistrez le débit à l’extrémité traversante en ml/min.
Pour normaliser la valeur du débit d'eau, divisez la valeur du débit d'eau calculée par la différence de pression transmembranaire et multipliez le facteur de correction de température dans le tableau suivant.
2.2.6 Concentration d'ultrafiltration
Lavez l'eau du système avec le tampon. Cycle pendant 5 minutes pour ajuster le pH et la stabilité des ions du système. Si la température doit être ajustée, poursuivez le cycle jusqu'à ce que la température du système soit stable.
Ajoutez le liquide d'alimentation dans le réservoir d'admission, définissez un débit d'alimentation (par exemple 400 LMH) et testez le débit de passage à différentes valeurs de TMP. D'après les données de test, les courbes ont été tracées avec TMP en abscisse et Flux en ordonnée.
Dirigez le tuyau d'extrémité vers un conteneur ou un drain approprié, tel que des réservoirs de collecte d'extrémité, des réservoirs de liquides usés et des drains de processus.
Enregistrez le poids initial du liquide d'alimentation dans le réservoir d'alimentation, démarrez la pompe d'alimentation et faites circuler lentement le liquide d'alimentation pendant 3 minutes à 4 minutes. La recirculation peut aider à éliminer l'air résiduel dans le trajet d'écoulement, maximisant ainsi les performances du film.
Ouvrez la vanne de passage, augmentez lentement la vitesse de la pompe jusqu'à ce que le débit tangentiel optimal soit atteint et ajustez la vanne de retour pour obtenir le TMP optimal du système.
Ensuite, placez le tube dans le récipient de collecte, commencez à chronométrer le moment où le liquide entre dans le récipient, enregistrez la pression d'entrée et de retour à des intervalles appropriés, et enregistrez la qualité du liquide au fil du temps à l'extrémité de retour et à l'extrémité de passage pour calculer la valeur instantanée. débit.
La concentration par ultrafiltration de l'échantillon est terminée lorsque le volume liquide de l'alimentation est réduit au volume de concentration cible.
2.2.7 Dialyse
Mettez le tuyau d'admission, le tuyau de réapprovisionnement et le tuyau de retour dans le réservoir d'admission, placez le tuyau de transmission dans le récipient de collecte et placez le récipient de collecte sur la balance pour le vider.
Ouvrez le clapet de retour, démarrez la pompe d'entrée, ouvrez le clapet de passage, ajustez la vitesse de la pompe et le TMP à la valeur appropriée. Ouvrez la pompe de réapprovisionnement, maintenez le volume de liquide dans le réservoir d'admission inchangé et démarrez la dialyse à volume égal. Commencez le chronométrage lorsque le liquide entre dans le récipient, enregistrez la pression à l'extrémité d'entrée, à l'extrémité de retour et la masse du liquide à l'intervalle de temps approprié, et obtenez le débit instantané par calcul.
2.2.8 PAC
Rincer d'abord avec du tampon, puis rincer à l'eau pour préparations injectables (opération 2.2.3), puis nettoyer avec un produit nettoyant (opération 2.2.4), et enfin rincer à l'eau pour préparations injectables (opération 2.2.3).
2.2.9 Test de flux d'eau
Le fonctionnement est le suivant : 2.4.5.
2.2.10 Conservation de la cassette membranaire
Stockage à court terme (inférieur ou égal à 3 jours), conservez la cassette à membrane dans l'appareil et utilisez la solution de stockage pour faire un cycle de 10 min à 15 min, fermez la vanne du système, coupez l'alimentation électrique de la pompe à liquide et assurez-vous que le réservoir d'arrivée de liquide est correctement fermé.
Si la durée de stockage est de 3 jours à 1 mois, veuillez retirer la cassette à membrane de l'appareil et la sceller dans un sac en plastique ou un autre contenant hermétique. Ajoutez environ 50 ml à 100 ml de solution de stockage dans un sac en plastique ou un récipient hermétique et fermez-le. Ou bien il peut être immergé directement dans la solution de stockage. Le tableau suivant recommande les conditions de stockage.
3 Résultats et analyse
3.1 Étude des facteurs influençant l'efficacité de l'élimination des pyrogènes
Pression de fonctionnement de l'ultrafiltration : 15 lots de tests ont été exécutés en continu. Dans chaque lot, la pression de filtration a été maintenue à 5, 10, 15 et 2{{10}}psi pendant l'ultrafiltration, et le liquide de récolte de virus a été concentré 30 fois et élué avec un liquide tampon. (10 fois le volume) en débit continu. Résultats comme indiqué dans le tableau ci-dessous, le taux d'élimination de l'endotoxine était inférieur à 87,0 %, le taux de récupération de l'antigène était stable à 86,0 % et le taux d'élimination de la protéine hôte était stable à 90,0 %, ce qui indique que différentes pressions de fonctionnement avaient peu d'influence sur l'effet de la récupération de l'antigène, de l'élimination des endotoxines et de l'élimination des protéines de l'hôte.
Rapport de concentration d'ultrafiltration : 15 lots de tests ont été exécutés en continu. Dans chaque lot, le liquide de récolte de virus a été concentré respectivement 30 fois, 50 fois, 80 fois et 100 fois pendant l'ultrafiltration. La pression de filtration a été maintenue à 20 psi et le liquide tampon (10 fois le volume) a été élué en flux continu. Résultats, comme indiqué dans le tableau suivant, le taux d'élimination de l'endotoxine variait de 53,3 % à 86,9 %, le taux de récupération de l'antigène est resté stable à 86,0 % et le taux d'élimination de la protéine hôte est stable à 91,0 %. Lors d’un échantillonnage segmenté, aucun antigène n’a été détecté dans la solution de transmission et moins de 10 % de la protéine hôte est restée dans la solution virale concentrée. La concentration d'endotoxine dans la solution concentrée de virus a augmenté avec l'augmentation des temps de concentration, et le taux d'élimination de l'endotoxine était le plus élevé dans l'échantillon concentré de 80 fois, et le fabricant pouvait également considérer la concentration de 100 fois, ce qui non seulement amélioré l'efficacité de la production et réduit les coûts, mais a également répondu aux exigences de la production de vaccins.
3.2 Épuisement du flux de la cassette à membrane et régénération par nettoyage
Après traitement, le taux de récupération du flux membranaire était de 92,6 %. Le premier taux de récupération de la nouvelle cassette à membrane est normal, selon les propriétés d'observation actuelles du liquide d'alimentation, la prédiction ultérieure des deuxième et NTH fois, le taux de récupération du flux de la cassette à membrane sera proche des données après ce traitement, et ont tendance à être stables. Dans les 2 heures suivant une utilisation unique, l’épuisement de la cassette membranaire était idéal et seulement 10 % du flux membranaire était épuisé dans le cadre du fonctionnement global.
3.2.1 Épuisement du flux lors du traitement des cassettes membranaires
3.2.2 Résultat du nettoyage et de la régénération de la cassette à membrane
À propos du guidisme
Guidling Technology est une entreprise nationale de haute technologie axée sur les produits biopharmaceutiques, la culture cellulaire, la purification et la concentration de fluides biomédicaux, de diagnostic et industriels. Nous avons développé avec succès des dispositifs de filtration centrifuge, des cassettes d'ultrafiltration et de microfiltration, un filtre anti-virus, un système TFF, un filtre en profondeur, des fibres creuses, etc. qui répondent pleinement aux scénarios d'application des produits biopharmaceutiques, de la culture cellulaire, etc. Nos membranes et filtres à membrane sont largement utilisés en concentration, extraction et séparation de préfiltration, microfiltration, ultrafiltration et nanofiltration. Nos nombreuses gammes de produits, depuis les petites filtrations de laboratoire à usage unique jusqu'aux systèmes de filtration de production, en passant par les tests de stérilité, la fermentation, la culture cellulaire et bien plus encore, répondent aux besoins des tests et de la production. Guidling Technology est impatient de coopérer avec vous !