Processus de concentration d'ultrafiltration/diafiltration en aval : comment prévenir efficacement la perméation et la perte de protéines cibles

Processus de concentration par ultrafiltration/diafiltration en aval : comment prévenir efficacement la perméation et la perte des protéines cibles

Dans les processus de purification en aval des protéines recombinantes, des produits sanguins et d'autres produits biologiques, l'ultrafiltration/diafiltration (UF/DF) est utilisée pour la concentration des matières premières, l'échange de tampons et l'élimination des sels et des petites impuretés moléculaires-. La séparation est réalisée sur la base d'un tamisage membranaire : les grosses molécules telles que les anticorps monoclonaux (mAb) sont retenues par la membrane, tandis que les sels, les endotoxines, les protéines de cellules hôtes libres (HCP) et d'autres petites impuretés moléculaires - traversent la membrane et sont éliminées dans le perméat. Lors de la mise à l'échelle du processus-, une perte de protéine cible à travers la membrane peut facilement se produire, réduisant directement le rendement et augmentant les coûts des lots. Dans certaines conditions opératoires, des protéines peuvent être détectées dans le perméat, ce qui nécessite une détermination rapide pour savoir si les composants divulgués sont des mAb cibles intacts, des agrégats dégradés/fragmentés ou des protéines de cellules hôtes. Cet article est divisé en deux parties principales : il passe en revue les approches traditionnelles de contrôle de processus-et, en combinaison avec le plan d'expériences (DOE), établit une fenêtre de processus robuste, soutenue par plusieurs méthodes analytiques pour déterminer l'identité des protéines détectées dans le perméat.

 

 

I. Principales causes de la perméation des protéines cibles à travers la membrane pendant l'UF/DF

1. Pression transmembranaire excessive (TMP)
Lorsque la différence de pression à travers la membrane est trop élevée, l’entraînement du solvant est accru, forçant une partie de la protéine monomère à pénétrer dans le perméat. Lors de la mise à l'échelle-, le réservoir d'alimentation contient un plus grand volume de matériau et les fluctuations de pression dans la tuyauterie sont plus prononcées, ce qui rend la surpression transitoire plus probable qu'à l'échelle du laboratoire.

2. Débit tangentiel incorrect
Si le débit est trop faible, une couche de concentration dense-polarisation se forme à la surface de la membrane et la concentration locale en protéines peut dépasser le seuil de tolérance de la membrane. Si le débit est trop élevé, la contrainte de cisaillement peut provoquer un clivage structurel du mAb, générant ainsi des fragments de protéines plus petits pouvant passer librement à travers les pores de la membrane.

3. Concentration excessivement élevée de protéines dans la matière première
Lorsque la concentration en protéines dans l’aliment est trop élevée, les protéines s’accumulent à la surface de la membrane et certaines protéines monomères peuvent être transportées dans le perméat. Il s'agit d'un problème courant dans-la production à grande échelle.

4. pH ou conductivité en dehors de la plage du procédé
Les modifications des caractéristiques de charge de la protéine peuvent réduire son rayon d’hydratation et la taille apparente de ses particules, entraînant une perméation membranaire anormale.

5. Vieillissement de la cassette membranaire, flux diffusif élevé ou pré-conditionnement insuffisant
Les défauts physiques de la cassette membranaire peuvent directement provoquer une fuite de protéines et représenter un risque lié à l'équipement. Des CIP répétés avec des solutions fortement alcalines peuvent progressivement endommager le matériau de la membrane en polyéthersulfone (PES).

6. Volume de diafiltration excessif
Lors d'une diafiltration prolongée, un rinçage continu du solvant peut progressivement éliminer de petites quantités de protéines monomères.

 

II. Mesures pratiques traditionnelles pour prévenir la perméation et la perte de protéines cibles

(A) Contrôle des paramètres du processus

1. Contrôler la pression transmembranaire (TMP)
Définissez une limite d'avertissement de pression supérieure et établissez des alarmes de verrouillage pour éviter les impacts transitoires de haute pression sur la couche de membrane. Après avoir déterminé les paramètres de base à petite échelle, réduisez la pression de fonctionnement sûre pendant la production à grande échelle-et réservez une plage de tolérance de processus appropriée.

2. Optimiser le débit tangentiel
Établissez une couche limite stable et réduisez la polarisation de concentration à la surface de la membrane par flux croisé, minimisant ainsi l'accumulation de protéines sur la surface de la membrane à la source.

3. Limiter la concentration finale après concentration
Définir une limite de concentration basée sur les propriétés physico-chimiques de la protéine et éviter une concentration excessive des aliments. Pour les mAb, la concentration finale de routine ne dépasse généralement pas 50 mg/mL ; pour certains mAb sujets à l'agrégation-, la concentration doit être encore réduite.

4. Contrôler le pH et la conductivité des aliments
Maintenez une taille de particule hydratée stable de la protéine et évitez la contraction moléculaire causée par des perturbations acide/base ou de la force ionique.

(B) Équipement et contrôles de fonctionnement

1. Effectuez des tests d’intégrité des cassettes à membrane avant chaque lot
Effectuez un test de point de bulle-avant la production de chaque lot pour identifier les fibres de membrane cassées. Les cassettes à membrane endommagées doivent être jetées immédiatement pour éviter une fuite continue de protéines.

2. Standardiser la procédure de nettoyage CIP
Contrôlez la concentration de NaOH et le temps de contact. Après un nettoyage fortement alcalin, équilibrez complètement le matériau de la membrane pour réduire le risque de déformation des pores de la membrane.

3. Utiliser une diafiltration par étapes
Utilisez un échange de tampon de grand volume-au début pour éliminer les sels et ralentissez le débit de diafiltration à mesure que le point final approche afin de réduire l'entraînement et la perte de protéines.

 

III. Établir un espace de conception de processus via le DOE (caractérisation du processus QbD ; applicable à la soumission IND)

1. Dépistage des facteurs
Écran cinq paramètres clés du processus UF/DF (P) : pression transmembranaire, débit d’alimentation, concentration initiale en protéines, pH d’alimentation et température de fonctionnement.
Variables de réponse : rendement conservé, teneur en protéines dans le perméat, flux membranaire et pourcentage d'agrégats de poids -moléculaire- élevé.

Grâce à une analyse de signification, identifiez les facteurs clés qui contribuent à la fuite de protéines.

2. Modélisation de la surface de réponse
Sélectionnez les quatre paramètres les plus significatifs pour construire une surface de réponse et analyser les interactions entre les paramètres. Dans de nombreuses conditions de fonctionnement, un seul paramètre peut rester dans sa plage qualifiée, tandis que la combinaison de deux paramètres peut entraîner une perméation des protéines. De tels effets d'interaction ne peuvent pas être identifiés par le biais d'expériences traditionnelles-facteur-à-à la-fois. Sur la base du modèle, définissez un espace de conception exploitable. Tant que les paramètres du procédé restent dans cette plage, une rétention efficace des protéines peut être assurée tandis que les impuretés sont éliminées par diafiltration.

3. Pire défi-cas (obligatoire pour la caractérisation du processus)
Sélectionnez les paramètres de processus aux extrémités des limites de fonctionnement pour simuler la variabilité de fabrication : TMP maximum, débit transversal minimum et concentration limite supérieure en protéines. Vérifiez que même dans des conditions de fonctionnement extrêmes,-une perte de protéine cible à grande échelle ne se produit pas, répondant ainsi aux exigences d'examen du CMC.

 

IV. Plusieurs méthodes analytiques pour identifier les protéines détectées dans le perméat et distinguer les mAb cibles, les fragments de dégradation et les HCP

Sur la base des scénarios d’efficacité analytique, de coût et de soumission réglementaire, les méthodes peuvent être divisées en deux catégories : le dépistage rapide et les tests de confirmation. Les méthodes rapides doivent être privilégiées pour la surveillance de routine des processus ; lorsque des écarts anormaux se produisent, des méthodes d’identification précises doivent être utilisées.

1. Spectrophotométrie UV (dépistage en ligne rapide ; préféré pour la surveillance de routine des ateliers-au sol)
Recueillir le perméat et mesurer son absorbance A280. Cela peut uniquement déterminer si une protéine est présente dans le perméat et ne peut pas distinguer les espèces protéiques. Il est principalement utilisé pour la surveillance de routine des processus. Une valeur A280 en augmentation continue indique une aggravation des fuites de protéines et nécessite une suspension immédiate de la diafiltration et une enquête sur le processus.

2. Électrophorèse SDS-PAGE (méthode d'identification qualitative la plus couramment utilisée)
Utilisez l'électrophorèse réductrice et non-réductrice et comparez les positions des bandes avec celles du mAb cible dans la matière première :
1) Si la position de la bande correspond parfaitement à celle du mAb cible, le mAb intact a imprégné la membrane.
2) Si des bandes de poids-moléculaire-inférieures apparaissent, la protéine a subi un clivage hydrolytique, générant des fragments d'AcM.
3) Si les bandes sont dispersées avec plusieurs bandes diverses, la plupart sont des protéines de cellules hôtes (HCP) provenant de cellules hôtes d'E. coli/CHO plutôt que le produit cible.

3. Chromatographie d'exclusion de taille-haute performance-(HPSEC)
Séparez les composants en fonction de leur taille moléculaire et comparez leurs temps d'élution avec ceux du chromatogramme de la matière première :
- Un pic principal avec le même temps de rétention que le mAb indique une protéine cible intacte.
- Un pic élué plus tôt indique des agrégats/fragments de poids-moléculaire- élevé.
- Un pic élué plus tard indique des fragments de dégradation de faible-poids moléculaire-.
- L'absence d'un pic principal caractéristique indique des protéines d'impureté HCP.
Cette méthode peut fournir des données quantitatives et peut être incluse dans les rapports d'enquête sur les écarts de processus ; il est très bien accepté dans les documents de soumission clinique.

4. Test du kit ELISA de protéines cellulaires hôtes HCP-
Si une protéine est détectée dans le perméat, que le résultat ELISA est élevé et que HPSEC ne montre aucun pic caractéristique de mAb, le matériau divulgué peut essentiellement être déterminé comme étant des protéines de cellules hôtes CHO. Cela indique une élimination incomplète des impuretés lors de la purification en amont ; les impuretés sont éliminées pendant l'étape UF/DF et ne représentent pas une perte de produit.

5. Vérification par chromatographie d’affinité (chromatographie sur protéine A)
La protéine A se lie spécifiquement à la région Fc des mAb. Charger l'échantillon de perméat sur la colonne : l'apparition d'un pic d'élution caractéristique indique la présence d'anticorps cible intact ; l'absence de pic d'élution démontre que les protéines du perméat sont toutes des protéines d'impuretés.

6. Spectrométrie de masse (LC-MS) (traçabilité approfondie- ; utilisée pour l'investigation des écarts majeurs du processus)
LC-MS peut analyser directement la séquence d'acides aminés et déterminer avec précision l'origine de la protéine. Il est principalement utilisé pour enquêter sur des écarts difficiles ou inhabituels et n'est pas utilisé comme routine dans les tests de contrôle de processus -.

V. Actions correctives correspondant à différents résultats analytiques

1. mAb cible intact détecté dans le perméat
Réduire la pression transmembranaire et la concentration finale après concentration ; restreindre la plage de fonctionnement du procédé en fonction des résultats du DOE ; et vérifiez l’intégrité de la cassette à membrane.

2. Fragments de dégradation d'anticorps détectés dans le perméat
Étudier les contraintes de cisaillement tout au long du processus et les pH extrêmes ; optimiser l’étape d’inactivation virale en amont pour réduire le clivage des protéines.

3. Seules les protéines d'impuretés HCP détectées dans le perméat
Aucun ajustement des paramètres UF/DF n’est requis. Remontez le problème aux étapes de chromatographie précédentes et améliorez l'élimination des impuretés pendant la chromatographie d'affinité et d'échange d'ions -.

 

VI. Résumé

Pour éviter les fuites de protéines lors de l'UF/DF, le contrôle traditionnel des processus s'appuie sur l'expérience historique pour définir des paramètres ponctuels individuels, qui ne peuvent répondre de manière adéquate qu'à une production stable à petite échelle. Pour garantir des performances stables lors de la mise à l'échelle progressive du processus-, la caractérisation des processus basée sur le DOE- doit être utilisée pour établir un espace de conception de processus avec une tolérance suffisante. Le contrôle des paramètres basé sur des intervalles-peut compenser la variabilité de fabrication. Une fois la protéine détectée dans le perméat, un simple système de détection UV peut fournir un premier avertissement, suivi d'une électrophorèse, d'un HPSEC et d'un ELISA pour la traçabilité et l'identification. Cela permet une différenciation précise entre le produit cible et les impuretés de la cellule hôte-, permettant ainsi une enquête ciblée sur les causes profondes-et des actions correctives. Il s'agit également d'un composant de recherche standardisé actuellement inclus dans la documentation CMC pour les projets mAb.